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标题:【讨论帖】讨论高浓度咪唑对蛋白构象的影响

owanaka[使用道具]
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发表于 2013-10-26 23:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】讨论高浓度咪唑对蛋白构象的影响

His Tag因其小而纯化效率较高而受到很多人（包括我）的亲睐，可是当我们用高浓度咪唑将纯蛋白洗脱下来后，在降低咪唑浓度的过程中，本来溶得很好的蛋白确常常沉淀了，我对此很是想不通。

现在我有一个推测：高浓度的咪唑其实影响了蛋白的构像，而在降低咪唑浓度的过程中蛋白的构象发生了重折叠，正是这种重折叠导致了蛋白的沉淀。

我对此没有什么信心，请高手指教。多谢！
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wawa[使用道具]
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发表于 2013-10-26 23:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我遇到过用高浓度咪唑洗脱蛋白即发生沉淀的现象，不知道是不是也是你分析的原因
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newway[使用道具]
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发表于 2013-10-26 23:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

兄弟啊!!握手!!我也是一样的问题!!求了好几天了也没人回答!!

我是想要洗脱掉咪唑时,用PBS,PH值也对好了,可是一洗脱,咪唑出来后,蛋白就沉淀了啊!!哭!!!

有什么好办法么?
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-10-26 23:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议用不同的pH进行洗脱, 这样不会带来咪唑的问题
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newway[使用道具]
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发表于 2013-10-26 23:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上谢谢你的帮助!!!真的!!
我蛋白溶液的PH值为8.5左右不到9
透析液PBS的PH值为7
为什么还是会沉淀出来啊?
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daod[使用道具]
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发表于 2013-10-26 23:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是在换液的时候你的PH值经过了PI啊
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wsll[使用道具]
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发表于 2013-10-26 23:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我没看过有文献说咪唑会影响蛋白空间构象的，各位能否把具体用的缓冲液组成及pH详细写一下，也好分析。
我先谈几点我的经验吧，抛块砖。首先要排除是在非变性条件下用咪唑进行的洗脱，高浓度尿素最易导致蛋白沉淀；咪唑加入洗脱液后，溶液pH会升高，由其是高浓度情况下（如1M），一定要再调一次pH，不然过高的pH容易导致蛋白变性沉淀；咪唑还是比较贵的，能用低浓度洗脱就不要用高浓度了，这样后序处理也好办一些。
再进行咪唑梯度洗脱前，最好先进行几步pH降低的阶段洗脱，要保证目的蛋白不被洗脱，这样可以去除大部分杂质。我的经验是，洗脱液引入咪唑后，不管咪唑浓度多低，都会在除杂的过程中损失目的蛋白，所以pH除杂收率会高。
如果你的蛋白可以通过降低pH洗脱又在低 pH下稳定，就不要用咪唑了。竞争洗脱还有一种方式可以选择，那就是用提高的氯化铵浓度进行洗脱。
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newway[使用道具]
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发表于 2013-10-26 23:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上2位！我把我的过程再仔细说如下：

1、含50、100、300、500mmoL /L咪唑的0．5 mol／L NaC1、50 mmoL pH 6．8 磷酸钠缓冲液梯度分别洗脱结合好目的蛋白的Ni柱

2、收集洗脱液，经SDS-PAGE电泳判断条带较接近的几管洗脱液，合并

3、合并后的洗脱液放入透析袋，放脱盐缓冲液pH 7．4的PBS中透析（目的是透掉咪唑）

然后几个小时以后蛋白就变成沉淀析出来了，大概就是这么个情况，我蛋白的PI在网上算大概是4.7

hcy_sypu朋友，你说的意思我没太看明白，不是必须用咪唑去竞争嘛？怎么又说低PH值可以不用咪唑呢？还有“最好先进行几步pH降低的阶段洗脱”这句，随着我咪唑浓度的提高，PH值肯定是个上升的过程啊，这样离PI更远不是更不会析出了么？所以你说的“最好先进行几步pH降低的阶段洗脱”是如何进行呢？

最后“提高的氯化铵浓度进行洗脱”这个是指包涵体的么？还是另外一种不用咪唑的方法？我这种蛋白是可溶的，而且6个his基都带好了，竞争洗脱起来应该比较容易，可为什么会出问题呢？我的问题其实就是“为什么咪唑一透析蛋白就沉淀出来了”？

最后还是十分感谢你！盼复！
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2013-10-26 23:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

高浓度咪唑对蛋白影响，我没听说过。不过蛋白在高浓度盐中稳定后，如果直接放到盐浓度很低时，蛋白会出现沉淀的。所以有时在透析时，如果起始蛋白在高浓度盐液中，那么透析液盐浓度要有个逐渐降低的过程。
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any333[使用道具]
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发表于 2013-10-26 23:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 newway 于 2013-10-26 23:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢楼上2位！我把我的过程再仔细说如下：

1、含50、100、300、500mmoL /L咪唑的0．5 mol／L NaC1、50 mmoL pH 6．8 磷酸钠缓冲液梯度分别洗脱结合好目的蛋白的Ni柱

2、收集洗脱液，经SDS-PAGE电泳判断条带较接近的几管洗脱液 ...

很明显你的蛋白沉淀是因为溶液中的盐离子浓度降低造成的，绝对不是什么IMIDAZOLE的功劳。
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