【求助】硫酸铵沉淀求助

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标题:【求助】硫酸铵沉淀求助

seagate[使用道具]
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发表于 2013-10-27 10:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

FPLC分离一个蛋白酶，首先是硫酸铵沉淀，总感觉发毛。请老鸟们指点！！
1。硫酸铵加入后要沉淀多长时间。我沉过8小时，可是再过一夜后，溶液里又析出许多沉淀。是不是沉淀不完全？
2。透析袋到底要不要处理？我是将其泡在透析液里2小时，毛啊。。。
3。沉淀经透析后，溶解多长时间，要溶解到什么程度？我总感觉没溶解好。因为15k离心后，好多pellet。

问题多多，请高手帮忙啊。

另：哪里有FPLC好的参考书或资料？

mickeylin[使用道具]
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发表于 2013-10-27 10:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

硫酸胺一般才采用分级沉淀法，先从小浓度开始，在逐渐加大浓度，直到将硫酸铵浓度调至50%，基本上就达到沉淀所需蛋白的目的了。透析袋使用前要经过处理，当然不是简单的在透析液中泡这么简单，方法如下：0.5MEDTA.2Na 1ml加NaHCO3 10 克，补双蒸水至500 毫升，调PH至8.0，透析袋放其中煮10分钟；蒸馏水清洗干净，再放蒸馏水里煮10分钟，就可以用了！
注意，透析袋每次用之前都要经过这样的处理，处理后可以保存于%0.1叠氮化钠中或
50%甘油中。

seagate[使用道具]
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发表于 2013-10-27 10:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是做30％－60％cut，硫酸铵加到30％后，应该作用多长时间？然后用多少速度离心？沉淀怎么溶解？
谢谢

birdfish[使用道具]
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发表于 2013-10-27 10:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该作用多长时间？（可以在4度作用30分钟）；然后用多少速度离心？（只要将沉淀离心的比较完全即可）；沉淀怎么溶解？（视蛋白质性质以及后续的处理而异）。

ALALA[使用道具]
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发表于 2013-10-27 10:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

具体怎么做的，什么地方能看到啊?
我周一要做,到现在还没找到实验方法呢，那位大侠指点一下啊

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2013-10-27 10:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先用50%饱和硫酸铵沉淀，过夜后离心去上清，再用33%饱和硫酸铵沉淀，过夜后离心去上清，将沉淀溶于尽量少的生理盐水或PBS中，用生理盐水或PBS透析除盐即可。

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2013-10-27 10:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

忘了讲清楚，50%饱和硫酸铵沉淀要溶于原上清体积一半的生理盐水中，再往下做。

DNA[使用道具]
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发表于 2013-10-27 10:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

透析袋处理：
干燥的透析袋在制备时曾用10%甘油处理过，一般透析只要浸泡润湿，并用蒸馏水充分洗涤即可使用。
对于要求较高的实验，除将甘油洗净，还应将硫化物（约0.1%）及痕量的重金属除去,可参照whiteblue的方法。

nikun230[使用道具]
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发表于 2013-10-27 10:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是做30％－60％cut，硫酸铵加到30％后，应该作用多长时间？然后用多少速度离心？沉淀怎么溶解？
谢谢

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1.放4度，至少3小时！
2.一般10000－12000RPM。我建议用12000RPM。你上次说放一会又有沉淀产生我估计是离心转速不够！
3.沉淀ddH2o溶解即可！SDS-PAGE不会有任何影响！不过要做其他之用的话最好透析一下！
OK?

moonlight45[使用道具]
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发表于 2013-10-27 10:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

透析袋处理后可以保存于20%的酒精中吗？我可是把用过的透析袋蒸馏水洗后便保存于20%的酒精中了哎！

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