【分享帖】从一篇文章了解结构生物学

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标题:【分享帖】从一篇文章了解结构生物学

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发表于 2013-10-27 12:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本来也许应该放在最后的，但是我决定还是写在最前面的。
我想告诉大家，通过这次journal club，大家可以学到什么.
如果你对结构生物学一无所知：
通过这篇文章，你应该知道，结构解析有两个方法
NMR:用于解析比较小的蛋白，小于25kD，比较快速、简单。
复合物，大的蛋白：比较适合用晶体结构、共结晶。
如果你稍微懂一些结构生物学：
通过这篇文章,你可以知道蛋白结构解析的瓶颈是如何得到可溶蛋白，
通过FPLC可以很简单就可以知道两个蛋白是不是相互作用。
如果你比较了解结构生物学：
你只要知道有一种可以得到可溶蛋白的新方法就可以了。
anyway，希望每一个读到这篇文章的人，都可以得到自己的收获。

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发表于 2013-10-27 12:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先我们来看看这篇文章，是nature structure（全称NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY）上的一篇文章。nature structure 差不多是结构生物学领域最好的一篇杂志，影响因子12左右。

附件

2013-10-27 12:15

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发表于 2013-10-27 12:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
禽流感
全文应该非常容易找到。
我先简要介绍一下这篇文章。
这篇文章的主要内容或者亮点吧
1、提出了一种用于在一个全长蛋白中寻找可溶片段的方法。（ESPRIT）
2、第一次用这种方法得到了禽流感病毒RNA聚合酶亚基PB2中最C端的一个可溶片段。并用NMR方法解析这个这个片段的结构。并且用细胞生物学方法研究了这个片段in vivo的定位。
3、用晶体方法得到了这个片段和一个核孔运输蛋白的复合体的结构。

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发表于 2013-10-27 12:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
禽流感
背景知识（intruduction）：
这篇文章所要研究的一个蛋白是禽流感病毒RNA聚合酶中的一个亚基PB2.
RNA聚合酶是禽流感病毒中非常重要的一个蛋白，含有三个亚基PA, PB1 and PB2。
它在病毒的生活史中有两个方面的功能：
1、转录病毒基因组中所编码的蛋白。
2、复制整个病毒基因组。
正因为禽流感危害较大，这个蛋白又非常的重要，所以研究的特别的多，本文所研究的是PB2亚基，大小为759个氨基酸。

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2013-10-27 12:17

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发表于 2013-10-27 12:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
禽流感感染
背景知识：
目前在世界各地所采集的许多禽流感病毒株中，发现了很多的点突变，这些突变造成的巨大的危害之一就是能够是禽流感病毒，可以更换宿主，或者说能够让它感染哺乳动物，包括人。所以大家都很想弄清除的这些点突变的作用机理是什么。其中有些重要的点突变就是在RNA聚合酶的PB2亚基中。但是这些点突变的机制很难研究，因为到目前为止还没有可用的原子结构。
这是因为:一直得不到可溶的RNA聚合酶的亚基。没有了可溶的蛋白，就无法利用NMR或者X-ray晶体衍射解析其蛋白结构。

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2013-10-27 12:18

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发表于 2013-10-27 12:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
禽流感
因为得到可溶性的蛋白，是蛋白解析结构的前提。无论是NMR还是x-ray都首先需要的到可溶的蛋白。既然PB2的全长无法得到可溶表达，那么很多人都会想到克隆表达全长蛋白中的一个domain或者片段。但是由于目前关于禽流感RNA聚合酶生物信息学的知识非常的匮乏，无法用软件预测PB2全长蛋白中的domain的位置。
怎么办呢？

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2013-10-27 12:18

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发表于 2013-10-27 12:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

ESPRIT：expression of soluble proteins by random incremental truncation
翻译过来就是：(通过）随机增加末端切掉片段表达可溶蛋白。
通过名字我们也能猜出这种方法的含义：既然我们不知道全长蛋白中，哪一段单独表达会是可溶的，就只能通过随机的方法来寻找。我们可以从一个全长蛋白的N端或者C端（本文用的是从N端）随机的减掉一个AA，这样把任何一个可能都尝试了，就有可能找到可溶的片段。
PB2全长是759个AA，那么我们从N端一个一个切，那么我们如果得到759个construct就可以包括所有的可能了（C端也同样，但是本文没有做）。
理论上我们可以通过PCR实验，设计不同的引物，应该也可以实现，但是这样无论成本、劳动力都太大了。本篇文章用的就是一个创新的方法。
简单的描述一下：
就是首先将PB2基因查到PGEX中，然后用一种限制性酶切酶从5‘端把Pb2切开，然后用核酸外切酶3来处理，每隔一定时间取样，然后处理成平末端，用T4DNA连接酶重新连接成环，转化到DH5a中，提出痕量质粒转化到BL21中，然后检测可溶表达情况。
这里，我要补充一下，他们检测蛋白是否可溶的方法也比较新颖，通常我们在实验室都是用超声破碎，取全蛋白和上清分别取样跑胶比较而判断的。但是这种方法无法适合大规模的筛选。
本文用的方法，就是通过克隆的方法，在PB2基因的C末端加了14个AA的短肽，这个短肽能够在大肠杆菌体内被生物素修饰，在体外当加入fluorescent streptavidin之后，就能够通过荧光检测，这样就能够判断蛋白是不是可溶表达了。

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发表于 2013-10-27 12:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我自己总结的。
其实大家不用很详细的看。了解基本原理即可，知道有这么一种方法也就足够。
1 PB2 library vector construction.(Nde I,Not I and Nsi I）
(PCR:pb2+14biotin acceptor peptide + pmal-cg)
2 Truncation library construction.
(Not I and Nsi I, Exonuclease III time-dependent, MBN enzyme, T4DNA polymerase, T4DNA ligase, transform DH5a:24036 )
3 Colony picking.
(transform BL21:26880,robot:384-well plate with LB )
4 Preparation of colony array filters.
(nitrocellulose membrane, array, induce over LB )
5 Detection of biotinylated proteins.
(lysed in situ and streptavidin conjugates used to detect biotinylated proteins)
6 Further data analysis. (300 clones)

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2013-10-27 12:20

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发表于 2013-10-27 12:20 资料个人空间短消息加为好友

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通过荧光检测就能得到能够可溶表达的片段了。
下图是荧光检测的结果，和所用的大规模筛选所用到的仪器。

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2013-10-27 12:20

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发表于 2013-10-27 12:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

通过PCR，就很容易知道，可溶表达的片段了，最终的结果找了两个片段：678–759 (designated DPDE, from the first four residues) 和661–759 (TTKR)。后者只是多了N端的一段loop而已。本文后面的研究对象都是 DPDE。
给大家一个印象：下图中红色的部分，就是通过这种方法得到的可溶的表达片段。

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