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标题:【讨论帖】WB 膜蛋白内参的选择

尘朵朵[使用道具]
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【讨论帖】WB 膜蛋白内参的选择


最近在做WB,用的是膜蛋白,现在想用内参检测下上样量是否相等,可是没找到合适的蛋白做内参。在园子里搜了关于内参的帖子,发现很多人都有我这样的疑惑,而且众说纷纭,没有一个统一的说法。
关于是否可以用β-actin 和 GAPDH 做膜蛋白的内参大家也是各持其见

1.不支持的:认为β-actin 和GAPDH是在胞浆中表达的,膜中应该不含有该成分,故不能用来做内部参照,可以用来检测所提的膜蛋白是否纯
2.支持的:他们通过实践行动证实,用β-actin或GAPDH孵育膜可以得到条带

本人倾向于第一种观点,查了些资料,都是说β-actin 和GAPDH是在胞浆中表达的,所以说就算是用上述两种内参孵育出条带也只是说明所提的膜蛋白成分不纯,含有胞浆成分,本人用β-actin孵育过膜,曝光后有相应条带出现,但很淡,但也证实用β-actin做膜蛋白的内参是确实是可以出条带的,但我的理解是膜蛋白成分不纯,含有胞浆成分

我看过两篇外文文献,用的是膜蛋白做WB,一篇是用actin做内参,04年发表在Am J Physiol Cell Physiol 上的。另一篇是用GAPDH,08年发表在 brain research上的,严格来说他不是用来做内参,只是检测膜蛋白成分是否纯

在此,希望大家充分发表自己的意见,充分讨论:
1.膜蛋白是否可以用β-actin 和GAPDH做内参?
2.很多人用β-actin 和GAPDH做内参时出来的条带是否是由于膜蛋白不纯,含有胞浆成分?如果是的话,是否可以用β-actin 和GAPDH做膜蛋白的内参呢?如果不是的话,是否细胞膜中本身就含有actin ?
3.细胞膜上是否有像β-actin 和GAPDH一样的看家蛋白可做内参?

欢迎大家不吝赐教,踊跃发言,把好的文献传上来一起分享!
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缘yuan[使用道具]
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膜蛋白一般用Na/K ATPase作为内参,这已经是公认的了。
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尘朵朵[使用道具]
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我现在做的指标就是Na/K ATPase,总不可能用他做内参吧
而且我跑出来的结果是有变化的,就是没东西验证这种变化是否是由于上样量不等引起的,蛋白浓度我已测过
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阿k[使用道具]
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β-actin 和GAPDH是在胞浆中表达的,膜中应该不含有该成分,故不能用来做内部参照,可以用来检测所提的膜蛋白是否纯

我们提取膜蛋白, 无论是物理方法(密度剃度离心, 双水相)还是化学方法(各种公司的KIT), 提取的膜蛋白都不可能是完全纯的, 能够达到60-70%都是相当不错的了, 更不要说我们所希望得到的细胞质膜可能还包括了细胞中的亚细胞器的膜, 所以孵育得到条带是完全可能的。

至于质膜的标识蛋白, 也就是NA/K ATP酶(一种整合膜蛋白), 这个也是没有疑问的(各种integrin也算)至于是否能做内参就看你是不是在变化过程中让这些蛋白与你的体系一同变化了, 如果有, 那就是内参, 如果体系不同, 互相不影响, 那就只能算外参了。

提供一篇文献参考, 用的是NA/ K ATPASE

Quantitative analysis of Na, K-ATPase immunoreactivity in normal, BPH and PCa canine prostate. Panel A; results of image analysis experiments performed in triplicate comparing Na, K-ATPase expression levels in tissue sections immunoassayed with a polyclonal antibody to the α1 subunit of Na, K-ATPase under identical experimental conditions. Panels B and C; representative sections used for analysis. Panels D and E; plot profiles of Na, K-ATPase abundance in the BPH and PCa sections.


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人小鬼大[使用道具]
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向bcl-2,bid,bax这种线粒体膜蛋白,是应该用专门的膜蛋白提取试剂盒,还是提总蛋白测呢?可以用什么做内参啊?

NA/ K ATPASE是质膜蛋白,那线粒体膜蛋白是不是也有专门的内参啊?
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cbou876[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 尘朵朵 于 2013-10-27 16:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近在做WB,用的是膜蛋白,现在想用内参检测下上样量是否相等,可是没找到合适的蛋白做内参。在园子里搜了关于内参的帖子,发现很多人都有我这样的疑惑,而且众说纷纭,没有一个统一的说法。
关于是否可以用β-actin 和 GAPDH  ...

支持博主的观点,在一定浓度范围内β-actin 条带的密度与上样量呈正比。


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ns5fan[使用道具]
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也觉得楼上的楼上的观点有道理,但很多文献中分离膜性蛋白和胞浆蛋白的时候,膜性蛋白的内参也使用actin或gapdh。疑问中,这个问题值得关注
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尘朵朵[使用道具]
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根据蛋白浓度统一上样量跑了几次,变化都不稳定,又没找到内参,都不知道哪个才是真正的变化,western就只能暂时停止先
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purrr[使用道具]
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是的,我也很关心内参问题.全蛋白的内参,膜蛋白的内参和核蛋白的内参该如何选择呢?因为内参的选择关系到提的蛋白的准确与否以及结果的判断
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zhenxin[使用道具]
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我们是否可以这样做:膜蛋白依旧选用β-actin 或GAPDH做内参,最后都和总内参相比较!
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