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标题:【求助】跨膜蛋白的原核表达

爱老虎游tt[使用道具]
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发表于 2013-10-27 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】跨膜蛋白的原核表达


我现在在做一个跨膜蛋白的原核表达，载体是PGEX-4T-2,膜蛋白大小是64KD,菌株：BL21，我改变了诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度，但仍然没有表达，测序证实读码框是正确的。 同时空质粒PGEX-4T-2的融合蛋白也没有表达。我看到PRP曾经发了帖子说他把膜蛋白穿膜攀区域去掉，才能够表达，大家能给我提些意见吗？具体给我分析一下。我刚开始做，希望大家给我些指点，谢谢！
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seagate[使用道具]
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发表于 2013-10-27 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你怎么知道它没有表达？SDS-PAGE？
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爱老虎游tt[使用道具]
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发表于 2013-10-27 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

诱导前后在相应大小的marker对应处没有条带，这不就说明没有表达吗？
再就是我的蛋白表达出来是为了制备抗体，并不一定要有活性，这样需要加信号肽吗？
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发表于 2013-10-27 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果是这种情况最好是换载体和表达菌株。
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qhyu[使用道具]
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发表于 2013-10-27 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我去年十月作也是这样，有个夸膜区，用了PET30-a(+),pGEX-4T-1做载体都不行，用过0.5mol/L,1mol/L,2mol/L,4mol/L的IPTG进行诱导，和用BL21（DE3）及ROSETTA等大肠杆菌表达都不行。只好重新设计引物，把跨膜的6－19个氨基酸去掉，再用BL21（DE3）表达，就表达出来了，用1mol/LIPTG就行，1h就表达，量较大！
别人也告诉我有跨膜区用大肠杆菌表达可以表达，但我没作出来，那位高人指点一下！！
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发表于 2013-10-27 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
主要还是因为你的蛋白分子量太大了，既然你做多抗用，那么就选取其中一段，最好知道是胞外段用来免疫兔子好了，应该能制备出来多抗的。
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发表于 2013-10-27 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

去掉跨膜的个氨基酸必要，但去掉跨膜区以后，所剩C端最好要有5-10亲水氨基酸，如果还是疏水氨基酸，一样表达困难。个人经验，未必通用。
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发表于 2013-10-27 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也正在做原核表达，我的蛋白29KD，多种软件预测都有一个跨膜区，位置在90-110AA处。载体是PGEX-4T-3,菌株：BL21。表达的结果是全蛋白的表达量很高，去掉包含跨膜区的N端110AA的蛋白SD-PAGE表现出的量却很低，而且有分子量更低的杂带。在这里我有几个问题想请教：
1.原核表达的跨膜蛋白在菌体中会与膜系统结合吗？
2.去掉包含跨膜区的N端110AA的蛋白SD-PAGE表现出的量低是层析时出现的问题吗？
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大白菜[使用道具]
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发表于 2013-10-27 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的蛋白跨膜区位于C端。biocrysrain 的结果：好象跨膜区位于N端不影响表达。去掉包含跨膜区的N端，如产生了宿主菌易降解序列，蛋白表达量会下降。
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yychen[使用道具]
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发表于 2013-10-27 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从全蛋白和截短的蛋白的SDS-PAGE结果看，截短的蛋白确实部分降解了。不知道有没有什么办法可以降低这种酶解？
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