【求助】求助Western blot高手解惑

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】求助Western blot高手解惑

31 1/4 1 2 3 4 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】求助Western blot高手解惑

吉吉0120[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 114483
精华 0
积分 217
帖子 134
信誉分 100
可用分 1448
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态离线

发表于 2013-10-29 16:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近提取SD大鼠的大脑皮质层做WB，检测不同实验组蛋白激酶C的某个亚类的表达变化。上个星期做的时候，跑出了很漂亮的条带，以下是我的实验条件：上样量30ug/cm，电泳时浓缩胶60V，分离胶120V,转膜100V，1.5h,5%脱脂奶粉封闭2h,一抗4℃过夜（Abcam,1:1000）,二抗常温1.5h(1:15000 jackson),由于我预实验跑出来的背景较深，我洗膜都是15min,4次。发光液用的是thermo 的supersignal west pico,用west dura时会出现很脏的背景。本来继续把其他样品跑完，WB部分就接近尾声了，可是这个星期接连跑了六块胶，全部是白板，连内参都没看到。我的实验条件没有任何变化，可是就是跑不出任何结果来，我都快愁死了，**各位高手指点迷津。。。

yonger[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74174
精华 0
积分 572
帖子 803
信誉分 100
可用分 4861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态离线

发表于 2013-10-29 16:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有些时候就是手气，呵呵，我听我同学说做了好多，有一个指标只做出来一次，相同条件后来怎么做都不行。

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2013-10-29 16:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以先做做电泳，染胶试试，然后再做转膜的，一步步来，首先要保证电泳的没问题！有时候就是这样，不一定哪步出现问题就会导致得不到结果的

utt0989[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 78340
精华 1
积分 660
帖子 975
信誉分 102
可用分 5663
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-28
状态离线

发表于 2013-10-29 16:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

关键是一抗和二抗如果有条件换其他抗体试试如果其他蛋白能出来说明你做的过程没问题可能是抗体出了问题

吉吉0120[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 114483
精华 0
积分 217
帖子 134
信誉分 100
可用分 1448
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态离线

发表于 2013-10-29 16:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天重新跑胶了，蛋白样品没问题，转膜没问题，膜上是确定有蛋白的，敷ECL发光液时，可以肉眼看到荧光，但是都很快就淬灭了。压片后全是白板。。求解啊。。。

jujuba[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79697
精华 0
积分 612
帖子 903
信誉分 100
可用分 5331
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-14
状态离线

发表于 2013-10-29 16:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

又见荧光淬灭
保证容器洁净的前提下，降低一抗和二抗浓度试下

吉吉0120[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 114483
精华 0
积分 217
帖子 134
信誉分 100
可用分 1448
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态离线

发表于 2013-10-29 16:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 jujuba 于 2013-10-29 16:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

又见荧光淬灭
保证容器洁净的前提下，降低一抗和二抗浓度试下

我前面几次已经用这个一抗和二抗的浓度跑出了很清晰的条带了，后来突然就出现了白板，经过排查发现，膜上是有蛋白的，是在孵育发光液的时候，荧光迅速淬灭而洗片出现白板。。。前面的试剂我都重新配过了，发光液用的是pierce的dura，今年初新买的，难道是发光液的问题吗？可是我之前也是用这个发光液的啊。我现在很发愁，**各位高手指点一二。。。

吉吉0120[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 114483
精华 0
积分 217
帖子 134
信誉分 100
可用分 1448
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态离线

发表于 2013-10-29 16:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2013-10-29 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可以先做做电泳，染胶试试，然后再做转膜的，一步步来，首先要保证电泳的没问题！有时候就是这样，不一定哪步出现问题就会导致得不到结果的

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2013-10-29 16:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我今天又重新做了，电泳转膜都没问题，膜上可以染出清楚的条带，主要是在孵育发光液的时候，荧光迅速淬灭了，我以前是用pierce的picol可以跑出清晰的条带，今天换了灵敏度更高的dura，可以肉眼看见很亮的荧光，但是大概只有十几秒的时间就淬灭了，压片后，就出现了白板。。。实在找不出是什么原因，请问以您的经验，可能是什么引起的。。谢谢

====================================================================

可能是你的荧光淬灭太快了，可以借一下别的同学用的比较好的发光液
如果条带的蛋白量不是太少的话，可以试一下DAB的，有时候太过于敏感或许并不是最好的

吉吉0120[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 114483
精华 0
积分 217
帖子 134
信誉分 100
可用分 1448
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态离线

发表于 2013-10-29 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2013-10-29 16:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好，我今天又重新做了，电泳转膜都没问题，膜上可以染出清楚的条带，主要是在孵育发光液的时候，荧光迅速淬灭了，我以前是用pierce的picol可以跑出清晰的条带，今天换了灵敏度更高的dura，可以肉眼看见很亮的荧光，但是大概只有十几 ...

之前用pierce的pico一直都跑出很清楚的条带，什么条件都没改变的条件下，为什么会出现这样的情况？我实在找不出原因。

31 1/4 1 2 3 4 ››