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标题:【求助】蛋白复性高手请进

whitesheep[使用道具]
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发表于 2013-10-29 19:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白复性高手请进

最近纯化蛋白，目的蛋白都在沉淀中，等电点是5.3，分质量大约90kd。
下面是我的纯化复性方案，前高手指点，以少走弯路：
一 超声破胞分离包涵体
bufferA：10mM tris，1mM EDTA, 1% Triton×100，PH8.0 。每500ml菌用50ml破胞，3min。
二 洗涤包涵体（我准备洗涤到一定纯度后再复性，以避免复性后还要纯化）
buffer B: 10mM tris ，2M尿素，1mM EDTA,0.5%Triton×100。每500ml破胞后菌用10mlbuffer B洗涤两次。
三 溶解包涵体
buffer C： 8M尿素，10mM tris，1mM EDTA PH7.8. 每500ml菌，用3ml溶解，4℃过夜。
四 包涵体蛋白复性（稀释复兴法 空气氧化法）
buffer D: 10mMTris,2M尿素，β-巯基乙醇(需要多少？？？) ，PH8.0.
将3mlbuffer C溶解好的蛋白，滴入复性buffer中。
五：浓缩
六测活
我知道这个方案可能会有很多缺点，希望各位高手给与指导。还有就是我看文献很多人用50mM Tris ，20mM tris，Tris的浓度对buffer的影响是什么呢？还有人在buffer中加NaCl，它在buffer中又又什么作用呢？
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2013-10-29 19:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你加50mM β-巯基乙醇试试，我做的还行
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2013-10-29 19:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢。请问你用的buffer是tris浓度是多少的？
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2013-10-29 19:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议采用间歇式流加稀释复性法，原理在于将变性的蛋白分几次添加到复性缓冲液中，每次保证在在较低的浓度下进行，并且每次添加间隔足够的时间，使上次添加的变性蛋白在复性过程中越过易于形成蛋白聚集体的折叠中间体，从而能够提高复性收率。我用的复性缓冲液是：0.4mol/L L-Arg，0.5mol/L尿素，2mMol/L,DTT,0.1mMOL/LZNSO4,0.3MOL/LNACL,50mM Tris-HCL,PH7.0-8.0，复性温度：4度。精氨酸nacl的作用主要时稳定蛋白的折叠中间体.
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发表于 2013-10-29 19:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

现在已经用buffer B洗涤包含体两次，跑10%SDS-PAGE胶分析纯度，沉淀中目的条带比较浓，其它杂带都呈模糊状态。师兄说我上样浓度高了，胶有点跑糊了。我只上了7ul。然后用bufferC：尿素的浓度（4，6，8）依次溶解沉淀，用的是每100ml菌2ml buffer C。说是不同的尿素浓度可以溶解不同的蛋白，同时在选择纯度高的复性，到达一定的纯化目的。明天跑胶看结果好了
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2013-10-29 19:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
明天跑胶看结果后，想用稀释法复性，复性之前蛋白的浓度应该是多少?
蛋白在复性液中的浓度是多少合适？希望能得到大家的帮助，我是第一次做复性
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2013-10-29 19:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很高兴，我用4M尿素的buffer C溶解包涵体后，跑胶，目的条带的纯度目测能到80%,蛋白浓度为4.4mg/ml,于是决定复性。用buffer D ,稀释250倍，复性过夜。明天浓缩之后测活。好期待哦，希望一切顺利
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发表于 2013-10-29 19:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，你好，我想请教你一个问题，我要做多抗，我的目的蛋白也是大多数在包涵体中，那我是不是可以按照你的方法，洗涤一下包涵体，然后直接免疫就可以了？没有必要再复性，浓缩吧？
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发表于 2013-10-29 19:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主用稀释复性法需要复性多长时间，还有浓缩和测活各用什么方法。我的目的蛋白也是包涵体，用尿素洗涤后也很纯，只剩下两条杂带，但是复性效果很不理想，过柱基本不结合。我的蛋白用的标签是谷胱甘肽，复性方法是透析法。谢谢。
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发表于 2013-10-29 19:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
现代人类使用的蛋白在冷冻复性角度上需要做个简单分类，用不同策略予以区分对待——耐冻结和不耐冻结。
耐冻结的可以采用浮冰法解决复性问题，紧接着可以提取浮冰予以冻干处理直接获得冻干粉。实际使用中冻干粉由于储存运输方面的优势，是商业的不二选择，蛋白产品多数也都是竭尽全力走上这条线路的。
不耐冻结的需要特殊复性液配方，温控设备予以冷结晶（甚至可能要动用高压强）析出变性盐，在此权且不做介绍。
浮冰法复性蛋白质：
冰是单矿岩，在形成时会自动排出杂质，尿素和盐酸胍的密度都在1.33左右，所以在冻结时可以很方便的排出，效率非常高。但是肽链或蛋白质的密度由于造物的神奇总是跟水有太多的姻缘不肯离弃，也就无法有效排出。那么这个实验也就化繁至简到无以复加的地步。稍大塑料试管体积的包涵体变性液（建议8ml以上），加入合适的冻干保护剂，主要在侧壁包裹些毛巾之类保温材料，试管口部开放，用一根丝线栓块玻棒沉在液体中，静置于冰箱冷冻室冷冻。辛苦点，定期观察冻结情况。冻结的浮冰最好不要超过1cm厚，拉动丝线可以提出浮冰。一般的实验有1ml高浓度目的蛋白也就足够出结果了……
关于冻干保护剂主要是用其中对蛋白活性具有保护的成分，例如蔗糖，明胶，PVP之类，网上资料很多不再罗列。

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能说的详细些吗？具体实验步骤不是很懂？
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