【求助】做了五六次WB，内参都不出！

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标题:【求助】做了五六次WB，内参都不出！

菠萝喵[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

因为刚开始的时候是用的师姐留下的SDS，结成团了，实验室的老师说是过期的，后来就新买了SDS、甘氨酸、Tris碱重新配了液体也不出！配方是跟实验室的老师要的，人家也是这么配的，也跑的出来……
我的操作是这样的：
1、配胶，4℃冰箱过夜
2、次日，上样（湿加），跑电泳，80v40分钟左右，待蛋白跑过了浓缩胶降电压调到100v，刚好跑出胶时停止。
3、根据MARK割下内参所在区域（36kd），胶放到转膜液中。
4、PVDF膜剪好后在甲醇中涮15秒左右，转入转膜液中浸泡。
5、转膜，电流110mA，1小时。
6、5%封闭液封闭1小时。
7、TBST洗3分钟
8、孵内参，4℃，过夜。
9、次日，膜用TBST洗3分钟后显影（10分钟、30分钟不等，加了发光剂也未见荧光），什么也没有，白片一张
实验时间不多了！急啊！恳请各位多多指教啊！小女子不胜感激！

菠萝喵[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

补充：我用的内参是康成的GAPDH，不用孵二抗。

leifengta[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那还是一抗的问题我之前也跑不出来换了个一抗就好了

zhezhe[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

兄弟，我以前来这里求助都很少有高人来帮忙解决问题，看你这么可怜我决定帮你分析下原因。
首先，你蛋白样本是哪来的？有没有加蛋白酶抑制剂？怎么保存的？保存了多久？上样是多少ug？一般来说只要上样1ug蛋白就能看到很明显的GAPDH条带，假如蛋白有问题你是啥条带都看不到的。
其次，我认为westernblot实验步骤其实很简单，稍微注意一点都能做出条带来，只是好看不好看的区别。鉴于你内参条带看不到，如果靶蛋白也没有，最可能的是转膜有问题，比如膜和胶的层次放错了。你看看你的膜上有没有marker条带就大致明白了。
再次，康城的GAPDH抗体是很敏感很特异的，要4度保存，不能反复冻融，一般1：20000-40000就足足够了，假如抗体放得太久了，或者保存不好，也是做不出条带的。另外我不知道你是怎么孵抗体的，我想应该没有问题吧。
最后，你是用什么曝光的？我们是用专门的化学发光仪曝光，一般5-10s就能得到很好的条带。有的同学不会使用化学发光仪，所以无论怎么曝光都是白板一点都不稀奇。还有一种情况是蛋白上样量过高，一抗浓度也过高，导致过曝，ECL一加上去就被完全反应光了，等你拿去采集信号的时候当然是白板，不过这时你会发现膜上条带位置发黄。
你自己总结一下吧，多请教身边的老师和同学，上网请教实在是下下策。

莲花白[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

下面是我认为可能出的问题，仅作参考，按照你自己的情况看：
1.你的胶配出来之后可以直接用的，也可以保存一段时间，保存时间以不超过10天为宜，保存方法：用滤纸把胶包好，然后把滤纸打湿，装在密封袋中保持胶的湿润，保存过程中不可以把梳子拿下来。
2.你转膜时是‘转膜，电流110mA，1小时’，那么你转完膜后在膜上能看到Marker条带吗，如果膜上Marker条带没有或者是在胶上仍然能够看到marker条带的话，可能你的转膜时间不够或者之前存在问题；如果膜上Marker条带完整的话，那么可能是抗体的问题了，你看看是不是你的一抗过期了或者是保存方法不得当。康成的GAPDH还是很好用的

米囡[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果你确定转膜没有问题，显色可以不用发光的，直接用NBT和BCIP显色，既方便又快，我都是这么做的，效果很好

菠萝喵[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 zhezhe 于 2013-10-29 20:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

兄弟，我以前来这里求助都很少有高人来帮忙解决问题，看你这么可怜我决定帮你分析下原因。
首先，你蛋白样本是哪来的？有没有加蛋白酶抑制剂？怎么保存的？保存了多久？上样是多少ug？一般来说只要上样1ug蛋白就能看到很明显的GAPDH ...

非常感谢你的意见！！！
首先我的蛋白是从培养的肝癌细胞培养出来的，提蛋白的东西是买试剂盒，pierce的，M-PER® Mammalian P rotein Extraction Reagent，25平方厘米的细胞培养瓶，细胞长到80~90%，PBS洗三次，每次5毫升，然后用胰酶把细胞消化下来，放到离心管中，8000转5分钟，弃上清，加7毫升PBS，混匀，8000转5分钟，弃上清，再加7毫升PBS，混匀，8000转5分钟，弃上清，加提蛋白的那瓶东西，200微升，混匀，震荡，5分钟后，将这些液体移到1.5EP管中，常温，12000转10分钟，取上清，分装，-20℃保存，留一点BCA法测蛋白量，测得3~4微克这样。
这些蛋白三天后拿来做WB，100微升蛋白+25微升上样缓冲液，煮沸5分钟，常温冷却，上样量是30微升。
转膜液是用别人的（别人做得出来的），自己配的不敢用了。转完膜后能在膜上看到mark。
转膜的时候，夹子的黑面我放在下面，接着是一层海绵，三层滤纸，胶，PVDF膜，三层滤纸，一层海绵。
康城的内参是用一个老师的，别人也是用他的，也跑得出来，但是，是配好后分装几管，每次用完后放-20摄氏度保存，要用的时候才拿出来融。
目的我还没做，一抗是买sigma的，拿来做免疫组化，效果也不是很好~
ECL试剂盒是碧云天的，1：1配制，每次加完后，都没见过荧光。
我现在很纳闷啊！步骤的话，我跟周围的老师和同学说了，他们都说跟他们做的都一样的~
最后还是很感谢你的答复！

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发表于 2013-10-29 20:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由米囡于 2013-10-29 20:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果你确定转膜没有问题，显色可以不用发光的，直接用NBT和BCIP显色，既方便又快，我都是这么做的，效果很好

谢谢回复！
请问NBT和BCIP是什么东东呢？

菠萝喵[使用道具]
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原帖由 莲花白 于 2013-10-29 20:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

下面是我认为可能出的问题，仅作参考，按照你自己的情况看：
1.你的胶配出来之后可以直接用的，也可以保存一段时间，保存时间以不超过10天为宜，保存方法：用滤纸把胶包好，然后把滤纸打湿，装在密封袋中保持胶的湿润，保存过程中不可以 ...

谢谢你的回复！
1、胶的话，我是听前辈说，这样放4度过夜好一点，所以就跟着做了~如你所说，能马上用的话，那就更好了！
2、转完膜后膜上能看到完整的MARK，胶上没见有MARK的条带了。
3、至于抗体，我只跑了内参，目的没跑，所以，一抗、二抗都还没用上呢~但是内参是用完之后-20℃存放，用之前才拿出来解冻，而且我已经用了5次左右了还没换呢~我问过一个老师，他说这样不要紧……

菠萝喵[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 leifengta 于 2013-10-29 20:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那还是一抗的问题我之前也跑不出来换了个一抗就好了

谢谢你的回复！
我只跑了内参，目的还没跑呢……一抗还没用……

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