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标题:【求助】我的Ni-NTA柱在盐酸胍中脱色了

flyxx05[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我的Ni-NTA柱在盐酸胍中脱色了


我用的是QIAGEN的Ni树脂，用含6M盐酸胍的平衡buffer，pH8.0溶解了表达的包涵体蛋白，但是发现在上样的时候居然让我的Ni柱褪色了，变成了近白色，可是平衡buffer里只有磷酸二氢钠，氯化钠和6M盐酸胍，用NaOH调的pH值，为什么会让我的Ni柱脱色呢？请各位大侠赐教。
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BUK[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不易用NaOH调pH值
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 flyxx05 于 2013-10-29 20:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用的是QIAGEN的Ni树脂，用含6M盐酸胍的平衡buffer，pH8.0溶解了表达的包涵体蛋白，但是发现在上样的时候居然让我的Ni柱褪色了，变成了近白色，可是平衡buffer里只有磷酸二氢钠，氯化钠和6M盐酸胍，用NaOH调的pH值，为什么会让我的 ...

再生一下看看
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flyxx05[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可是QIAGEN的说明书上是用NaOH调pH值的啊？
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Three possibilities:
1. before you chaged your column with Ni2+, wether you cleaned the column with NaoH? if you did, maybe you did not fully wash away the NaOH and then start charging
2. your equilibrated buffer, you mentioned Pi, does pH ok, I mean not so much NaOH? same solution, keep NaOH (or high pH) away your Ni2+
3. your dissolved solution GudmHCl, contained too much DTT or reduced reagent. dilute you loading solution untill DTT acceptable ny Ni2+
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=pkchen=[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个不是脱色，不要着急。
Ni柱是蓝色的，挂上蛋白（即上样）后，Ni被置换下来，就成了白色，那是填料的颜色。您只要把您要的蛋白洗脱下来，然后重生ni柱，又会变成蓝色的了。
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发表于 2013-10-29 20:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一种可能是Ni离子已经从基质上脱落，你可以通过观察废液的颜色观察，要是废液是蓝绿色则验证上述的可能。这需要重生！
另外，可能是你的Ni离子连在基质上但是被还原了，颜色可能就变了，这一点我没有遇到过，就是看了一些资料，具体在哪看的记不得了，但愿没记错！
不当之处敬请高手指正，共同学习！
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langlang[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用过QIAGEN的Ni－NTA Superflow的柱料纯化复性后蛋白，在挂上蛋白后柱料变白是正常的，不知道变性蛋白在盐酸胍中挂上会是什么样，但可以肯定不是被还原了，被还原了柱料会变黑。
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做过的一个蛋白分子量很大，上柱之后填料变成淡黄色，猛一看还以为镍掉了。继续用500mM咪唑洗脱结果洗出来很多蛋白，填料也变回浅蓝色。可见蛋白结合量很大的时候会掩盖金属离子的颜色。

被还原的话应该是变棕黑色，自己取一点氯化镍加上DTT煮一下就明白了。
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skytree[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个不是脱色，不要着急。
Ni柱是蓝色的，挂上蛋白（即上样）后，Ni被置换下来，就成了白色，那是填料的颜色。您只要把您要的蛋白洗脱下来，然后重生ni柱，又会变成蓝色的了。

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完全错误的解释，Ni柱挂上蛋白后Ni依然和beads结合，由于蛋白在高浓度下显示黄色，所以Ni柱的颜色会更接近黄色。
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