【求助】共聚焦和免疫荧光有什么不同？

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标题:【求助】共聚焦和免疫荧光有什么不同？

婴儿脸[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好，请问为什么有些细胞在免疫荧光显微镜下有荧光而且可见清晰荧光分布的细胞在共聚焦显微镜下却显示不出荧光？怎样避免这种情况？是荧光抗体的浓度不够吗？但是我用的是有效价浓度的两倍浓度的。请各位大师帮忙！！！谢谢！！！

dreaming[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 婴儿脸 于 2013-10-29 20:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

大家好，请问为什么有些细胞在免疫荧光显微镜下有荧光而且可见清晰荧光分布的细胞在共聚焦显微镜下却显示不出荧光？怎样避免这种情况？是荧光抗体的浓度不够吗？但是我用的是有效价浓度的两倍浓度的。请各位大师帮忙！！！谢谢！！！ ...

怎么会呢？
我的第一感觉是不是你的共聚焦显微镜没有调好啊？通道不对激发光不对么？

因为我们通常是先在自己实验室用普通荧光显微镜看看有没有荧光，如果有荧光就去共聚焦下面做。因为共聚焦是按小时收费的，比普通荧光显微镜贵10倍左右。一般只要普通荧光显微镜下能够看到荧光，共聚焦下面肯定会有的。
我只碰到过普通荧光显微镜下面看不到而去了共聚焦下面反而可以激发出荧光的情况。
或者你两次观察的时间一个在前一个在后，隔的时间较长，避光不好，导致荧光淬灭。

又或者你先用荧光显微镜观察过了，荧光被激发后持续发出荧光的时间是有限的，等你再次激发的时候光就非常弱的。我就碰到过在显微镜下面看着看着荧光就慢慢变暗的时候，所以只要看到荧光，调好焦距就要抓紧拍照，不要犹豫。

dreaming[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

但是我是做完共聚焦回来在科室的荧光显微镜下观察，只要有细胞就有荧光染色，但是很模糊.
还有我的细胞是悬浮细胞，每次漂洗都会减少很多细胞，最好所剩无几，请问有什么方法固定悬浮细胞吗？
谢谢！！！

dreaming[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做完共聚焦之后再回来自己实验室看，只有细胞核的hoechest依旧有颜色，而胞浆的荧光则消失的很明显。
其实在共聚焦下面也一样，你激发过看过的视野，如果再次激发在拍照，效果就差不少。
所以应该不是你实验protocol的问题，但是不知道试剂公司卖的抗淬灭的东西是不是有这个效果。我没试过。

悬浮的细胞每次洗后离心应该损失不多吧，把最初的细胞量搞多一点应该还好吧。我只发愁每次滴片的细胞太密了，照出来不好看呢，总要再稀释再重新滴片。
试剂公司也有卖那种预处理好了的玻片，细胞在上面不容易掉，我师姐用过，据说效果还可以。

cocacola[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

激光共聚显微镜特别适合两种或两种以上的染料染色过的标本

tianmei001[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

或者你两次观察的时间一个在前一个在后，隔的时间较长，避光不好，导致荧光淬灭。

又或者你先用荧光显微镜观察过了，荧光被激发后持续发出荧光的时间是有限的，等你再次激发的时候光就非常弱的。

=============

这种可能性最大

ffaa[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

封片如果用prolong gold，保存的时间是相当长的。我甚至过了两个月再看，还有比较好的荧光。不知道大家都用什么方法。

婴儿脸[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想还有一个可能:我曾经有过在荧光下看双染的细胞,红绿两种颜色都有,一种(绿)强,另一种(红)是细胞普遍有弱光,有的地方有星星点点分布的强光,二者分布略有差异.但第一次在激光下扫描出来的与肉眼在荧光镜下看到的不同,是二者共同分布,强度相似.细胞轮廓还比较清晰.当时的扫描模式是普通的模式,即同时进行两种荧光的激发.

可是实际上该标本的荧光标记应该出现在不同部位,在咨询技术支持后他认为可能是荧光串色的问题,即两种染料的发射波长有部分重叠导致的,建议改用顺序扫描的方法.就是先激发一种,进行扫描,再激发一种,进行另一荧光的捕捉,缺点就是扫描速度慢多了.

这样处理后,两种颜色分开了,弱的那个(红色)在共聚焦的扫描视野中几乎没有(其实是凋亡的标记,当时是正常组,本就应该很少).
在这种情况下,我切换到共聚焦显微镜的目镜,用肉眼看荧光,红色的荧光是能看到的,而且细胞表现为弱的全细胞都能看到的颜色,这种情况应该是激发出来的荧光有串色的可能性,即激发的能量较强,使我们能看到较宽的光谱,而在激光扫描的情况下,激发的带宽比较窄,针对染料的特异激发比较强,那么可能扫描出来的不如肉眼看到的东西多,其实是特异性更强了.
另外的一个可能性就是选择的激发光谱与染料的有偏差.对于熟练的操作人员来说,这种可能性不大.你应该将染料的名称或激发\发射光谱准确告知操作人员.

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2013-10-29 20:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

悬浮细胞免疫染色前你可以用多聚赖氨酸或明胶包被，然后涂细胞悬液然后在37度加热板上加热过夜，再染色，这样细胞就可以比较牢固的粘在片上了。你说在共聚焦显微镜下观察没有荧光，很可能是你在普通荧光显微镜下看的时间太久了，或者是你的荧光本来就很弱，共聚焦在操作时会把背景色给去除，染色的荧光太弱的话，共聚焦有可能把它当作背景色去掉了。