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标题:【求助】关于mTOR蛋白 WB的若干问题 拜请赐教

veiwu[使用道具]
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发表于 2013-10-29 22:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于mTOR蛋白 WB的若干问题 拜请赐教

最近做MTOR和p-mtor 一直没有结果 请问有做过这个通道 并出结果的高人吗？
我是用cst抗体
浓缩胶4% 分离胶6%，电泳 80v 30min，120v 1.5h， 转膜 70v 恒压 3.5h

一直没有条带

请高手指点 因为特别急 所以
麻烦大家啦！！！
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nikun230[使用道具]
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发表于 2013-10-29 22:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的蛋白样品来自哪里？怎么处理的？
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-10-29 22:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 veiwu 于 2013-10-29 22:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近做MTOR和p-mtor 一直没有结果 请问有做过这个通道 并出结果的高人吗？
我是用cst抗体
浓缩胶4% 分离胶6%，电泳 80v 30min，120v 1.5h， 转膜 70v 恒压 3.5h

一直没有条带

请高手指点 因为特别急 所以
麻烦大家啦！！！ ...

估计还是抗体选择的问题吧。推荐一个网站：
cuturl('http://www.labome.com/review/gene/human/mTOR-antibody-all-methods.html') （mTOR相关抗体的文献引用情况）
cuturl('http://www.labome.com/gene/human/mTOR-antibody.html') （可供选择的商品化mTOR抗体）

你可以根据已有的文献报道来选择合适的抗体。里面也有cst的抗体引用情况，你可以看下别人是怎么做的。希望对你有帮助。
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veiwu[使用道具]
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发表于 2013-10-29 22:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是做大鼠间充质干细胞的，在六孔板里面刺激完后 直接提取蛋白
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koook5695[使用道具]
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发表于 2013-10-29 22:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的细胞量够不够，蛋白测定浓度怎么样？
我做过动物组织mTOR WB测定，效果还可以，听师兄师姐说过，细胞提取的蛋白量很少，可能跟这有关系。另外，向上面说的，抗体不好也可能出不来条带。
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发表于 2013-10-29 22:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的细胞量够不够，蛋白测定浓度怎么样？
我做过动物组织mTOR WB测定，效果还可以，听师兄师姐说过，细胞提取的蛋白量很少，可能跟这有关系。另外，向上面说的，抗体不好也可能出不来条带。

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蛋白浓度 还是不错的 大概8mg/ml的样子，而且我加样一般是20~30ul的加，另外我的抗体是CST的，我看得文献都是用CST的，所以买这个的。 和你一样 我也是骨科的 呵呵
请问你的条件是什么啊？比如电泳 和 转膜条件 另外 你副完二抗 后 是洗 5分钟 3次 还是15分钟 3次?
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veiwu[使用道具]
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发表于 2013-10-29 22:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的蛋白样品来自哪里？怎么处理的？

=========================================================

您好 我的样品蛋白是间充质干细胞 用ripa+pmsf裂解 然后离心取上清液
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linlinstar[使用道具]
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发表于 2013-10-29 22:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我之前做是santa的抗体，200mA转膜3小时（在冰中）。因其蛋白较大，在提取和电泳时应注意低温操作。电泳的胶浓度太小，不利于蛋白分离，可能造成混杂，不利于抗体结合。我之前5%浓缩胶，10-12%分离胶
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-10-29 22:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的细胞量够不够，蛋白测定浓度怎么样？
我做过动物组织mTOR WB测定，效果还可以，听师兄师姐说过，细胞提取的蛋白量很少，可能跟这有关系。另外，向上面说的，抗体不好也可能出不来条带。

===================================================================

兄弟，你的内参和目的蛋白是怎么解决的呢？分开跑两块胶还是怎么的呢？非常感谢！
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veiwu[使用道具]
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发表于 2013-10-29 22:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我之前做是santa的抗体，200mA转膜3小时（在冰中）。因其蛋白较大，在提取和电泳时应注意低温操作。电泳的胶浓度太小，不利于蛋白分离，可能造成混杂，不利于抗体结合。我之前5%浓缩胶，10-12%分离胶

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您的意思是 电泳时就要加冰块？ 然后不是说 做大分子蛋白 尽量用小点的胶，这样 大分子蛋白才更容易进入胶内，胶浓度大了，孔径相对就小了，然后大分子蛋白就挡了很多在外面，进不来，网上感觉大部分就是推荐用6%的胶，还有少数人推荐用8%，请问用10%和12%的胶可以做出来吗？不是超过他标的适应KD值了吗？请指教
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