【求助】镍柱蛋白纯化的问题

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标题:【求助】镍柱蛋白纯化的问题

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发表于 2013-10-31 16:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友，大家好，我是一个原核表达纯化的新手，手里有两个待纯化的蛋白，准备纯化脱盐后给细胞用。
蛋白是在N端有6his标签，用的是Ni柱纯化（AKTA一款比较老的纯化仪）。
大致步骤如下：
1 冰上超声破菌，离心，上清过滤
2 用GE的Ni柱（1ml新柱子），20%乙醇洗，再用binding buffer（20mM磷酸钠 0.5M氯化钠 PH 7.4）平衡柱子
3 将溶解在binding buffer中的菌液上清上样
4 待上样完成后用binding buffer 再平衡
5 用50mM,100mM，150mM...1M咪唑梯度洗脱。
6 取洗脱峰出现位置及其附近的洗脱液做考染检测。
峰图：洗脱峰出现的前后接了四管洗脱液做考染鉴定

附件

2013-10-31 16:54

54796462.jpg (31.96 KB)

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发表于 2013-10-31 16:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

遇到问题：洗脱峰接到的杂蛋白太多，跟没有纯化一样！
考染图

蛋白在50kd左右。
恳请大家帮我出出主意，不胜感激！
PS：这两个蛋白都用的新柱子，都是在100mM咪唑浓度时洗下来大量的杂蛋白。峰图也基本相同。

附件

2013-10-31 16:54

68951131.snap.jpg (24.76 KB)

ha111[使用道具]
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发表于 2013-10-31 16:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的目标带是哪个，有没有标签啊大约什么浓度出峰，太低浓度洗脱与杂质很难分开

ha111[使用道具]
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发表于 2013-10-31 16:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，你的胶没任何指示和说明，不知道各泳道代表什么，哪个是目的蛋白。
其次，你最好先确定目的蛋白是否有表达，最好加个未诱导的作为对照。
最后，不知道你摇菌的体积，有时候如果上样的总蛋白量过大，超过填料结合的能力的话，起到的纯化效果会大打折扣的。

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发表于 2013-10-31 16:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的目标带是哪个，有没有标签啊大约什么浓度出峰，太低浓度洗脱与杂质很难分开

===============

N端6his标签

附件

2013-10-31 16:56

87274983.jpg (53.36 KB)

2013-10-31 16:56

12358669.jpg (55.84 KB)

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发表于 2013-10-31 16:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，你的胶没任何指示和说明，不知道各泳道代表什么，哪个是目的蛋白。
其次，你最好先确定目的蛋白是否有表达，最好加个未诱导的作为对照。
最后，不知道你摇菌的体积，有时候如果上样的总蛋白量过大，超过填料结合的能力的话，起到的纯化效果会大打折扣的。

===============================================================================

蛋白确定有表达，几乎全部为可溶性，这个已经验证过了，摇菌体积为400ml。现在看来几乎没有纯化效果。
图片补充信息在楼上。谢谢。

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发表于 2013-10-31 16:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你不同的浓度洗脱收集到的洗脱液体积各是多少，SDS-PAGE的上样的洗脱液体积是多少？

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发表于 2013-10-31 16:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Ni柱的缺点就是特异性其实不强，样品里加40mM咪唑可以改善

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发表于 2013-10-31 16:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

从来没有遇到纯化效果这样的情况，严重怀疑你的纯化体系有问题
表达还是很明显的，建议复查下缓冲液PH值，咪唑浓度等等。

hustwb[使用道具]
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发表于 2013-10-31 17:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一，由于组氨酸标签本身的小Tag性质，使得蛋白结合可能带有稍许的非特异性特征，但这个和目的蛋白的性质相关。从您的蛋白图谱看，杂蛋白的表达也很丰富，目的蛋白的结合优势并不突出。建议在平衡Buffer里，加入少量20mM-40mM的咪唑，减少非特异性蛋白的吸附。
第二，跑SDS胶时，尽量增加对比样品的Line，使得结果更为严谨，方便分析。比如细菌裂解液、流穿液、各浓度的洗脱液，都应各取相同体积上样。这样可以知道目的蛋白的表达水平怎样？挂柱是否充分？
第三，您后面图片上添加的“目的蛋白”箭头是否指反了？如果目的蛋白是100mMLine上那条粗条带，50mM,150mM都由目的条带，不妨可增加一个75mM的梯度。

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