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» 酶联免疫吸附法测定人绒毛膜促性腺激素(一)
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标题:酶联免疫吸附法测定人绒毛膜促性腺激素(一)
rmhot
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精华
1
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状态 离线
1
发表于 2013-10-31 20:34
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酶联免疫吸附法测定人绒毛膜促性腺激素(一)
关键词:一级标准物质
食品添加剂检测
环保标准样品
标准品进口
【实验原理】
酶联免疫吸附试验
(ELISA)
是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体
(
聚苯乙烯微量反应板
)
表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除将标准品、待测样本加入到预先包被
hCG
单克隆抗体
(McAb)
透明酶标包被板中,温育足够时间后,洗涤除去未结合的成分,再加入酶标工作液,温育足够时间后,洗涤除去未结合的成分。加入底物四甲基联苯胺
(TMB)
在辣根过氧化物酶
(HRP)
催化下转化为蓝色产物,在酸的作用下变成黄色,颜色的深浅与样品中人
hCG
浓度呈正相关,
450nm
波长下测定
A
值,根据标准品的浓度及对应的
A
值,可计算出样品浓度。
【试剂与仪器】
酶联免疫试剂盒测定
hCG
的主要试剂与仪器:
1
.包被固相载体用的
β
-hCG
亚基
McAb
2
.辣根过氧化物酶
(HRP)
标记的
β
-hCG
亚基
McAb
3
.在
HRP
反应中作底物的
TMB
4
.
H
2SO4终止液
5
.
37℃
恒温箱
6
.标准规格酶标仪
【操作步骤】
1
.样本
(1)
收集晨尿,
1500
~
2000r
/
min
离心
10
分钟,取上清液待测。
(2)
采血不加抗凝剂,尽快分离血清待测。
2
.准备 从冰箱取出试剂盒,室温复温平衡
30
分钟。
3
.配液 用蒸馏水将
20
倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
4
.加标准品和待测样本 取足够数量的酶标包被板,固定于框架上,分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔,记录各孔位置,在标准品孔中加入标准品
50µl
;待测样本孔中先加入待测样本
10µl
,再加样本稀释液
40gl(
即样本稀释
5
倍
)
;空白对照孔不加。
5
.温育
37℃
水浴锅或恒温箱温育
30
分钟。
6
.洗板 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置
1
分钟,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板
4
次
(
也可用洗板机按说明书操作洗板
)
。
7
.加酶标工作液 每孔加入酶标工作液
50µl
,空白对照孔不加。
8
.温育
37℃
水浴锅或恒温箱温育
30
分钟。
9
.洗板 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置
1
分钟,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板
4
次
(
也可用洗板机按说明书操作洗板
)
。
1 0
.显色 每孔先加入显色剂
A
液
50μl
,再加入显色剂
B
液
50μl
,平板混匀器混匀
30
秒
(
或用手轻轻振荡混匀
30
秒
)
,
37℃
避光显色
15
分钟。
11
.终止 取出酶标板,每孔加终止液
50μl
,终止反应
(
颜色由蓝色立转为黄色
)
。
12
.测定 以空白孔调零,在终止后
15
分钟内,用
450nm
波长测量各孔的吸光值
(A
值
)
。
13
.计算根据标准品的浓度及对应的
A
值,可计算出样品浓度。
标准品进口:
http://www.rmhot.com/plist_5/plist_5_0_0_1.html
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