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葡萄糖的测定(一)

关键词:
国家标准物质  生物成分分析标准物质  环境检测标准物质  药品标准物质
葡萄糖是生物界一种重要的单糖，其结构是六碳呋喃糖，分子式为C6H12O6，相对分子质量为180．1。在自然界中只有少数的天然食物含有游离的葡萄糖，如葡萄。但蔗糖、乳糖、淀粉等碳水化合物的水解物中都含有葡萄糖。
葡萄糖的测定方法主要有化学法、酶法和高效液相法。葡萄糖具有还原性，可用还原糖法的测定方法测定，但是还原糖法特异性较差，如果样品中混有其他还原糖可使结果偏高。酶法采用的酶可选择性地水解葡萄糖，方法的特异性较强，是测定葡萄糖，包括血糖常选用的方法。常用的酶法有葡萄糖氧化酶法和己糖激酶法，这里介绍葡萄糖氧化酶法。
1．原理
葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使邻联甲苯胺生成蓝色物质，该有色物质在625 nm波长下与葡萄糖浓度成正比。通过侧定蓝色物质的吸光度值可计算样品中葡萄糖的含量。
2．仪器
①实验室常用设备。
②722型分光光度计。
3．试剂
除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。
①三氯乙酸(40％)：称取4．0 g三氯乙酸，用水溶解并稀释至100 mL。
②无水乙醇。
③2 mol·L-1NaOH溶液：称取8 g NaOH，用水溶解并稀释至100 mL。
④1％邻联甲苯胺溶液：称取0．1 g邻联甲苯胺溶解于10 mL无水乙醇中，倒人棕色瓶中，4℃冰箱保存。
⑤乙酸缓冲液(pH5．0)：称取14．28 g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)溶于水中，加入2．7 mL冰乙酸，使pH为5．0，用水定容至1L。
    ⑥葡萄糖氧化酶溶液：称取一定量的葡萄糖氧化酶(Sigma公司)用水溶解，使酶含量为100U／mL。4℃冰箱保存一周。
⑦过氧化物酶溶液：0．010 g辣根过氧化物酶溶于10 mL水中，4℃冰箱保存一周。
⑧酶溶液：取100 mL乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、过氧化物酶溶液各l mL，混匀。4℃冰箱可保存7周。
⑨酶空白液：取100 mL乙酸缓冲液，分别加人邻联甲苯胺溶液、过氧化物酶溶液各l mL，混匀。4℃冰箱保存1周。(注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶)
⑩葡萄糖标准液：将葡萄糖标准品(纯度大于99％)于80℃干燥至恒量。精确称取0．050 g，用水移人100 mL容量瓶中，定容至刻度线。此标准液相当于浓度为0．5 mg·mL-1