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标题:【求助】creb和p-creb

misswu61[使用道具]
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发表于 2013-11-5 22:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】creb和p-creb

哪位高手有做过creb和p-creb，自己最近在做,一二抗的浓度都是1：500，cell signal的抗体，分离胶10% 浓缩胶4%，电泳80V 20min,100V 60min,转膜300mA 60min, 结果是：creb的条带极微弱，p-creb的没有条带，不知道该怎样改进条件？ 谢谢大家踊跃帮忙 creb和p-creb的分子量是43kd
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summerxx[使用道具]
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发表于 2013-11-5 22:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先，应该明确你的蛋白有没有问题，加没有加磷酸酶抑制剂？提取的时候是否注意低温操作？另外上样量是否够？抗体是先孵creb，洗脱液洗完后再孵的p-creb？还是分开孵的？延长抗体孵育时间。
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-11-5 22:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主你抗体浓度好大啊~~ 我最近也在做 没条带 很困惑~
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misswu61[使用道具]
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发表于 2013-11-5 22:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 abc816 于 2013-11-5 22:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主你抗体浓度好大啊~~ 我最近也在做 没条带 很困惑~

CREB好做
但是p-CREB不太好做
可能是样品没有表达，亦或是抗体的特异性不好
用过几个p-creb的抗体
效果都不好
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发表于 2013-11-5 22:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 misswu61 于 2013-11-5 22:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


CREB好做
但是p-CREB不太好做
可能是样品没有表达，亦或是抗体的特异性不好
用过几个p-creb的抗体
效果都不好

我用的是小鼠的海马，可参考的文献并不多，感觉很多条件都试过了，但就是没结果，挺郁闷的。我同时还做了一个14kda的BDNF， 也是没条带，但是actin一直很好，哎~~ 现在正在跟公司投诉呢~~不知道哪里出问题了~~
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misswu61[使用道具]
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发表于 2013-11-5 22:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

BDNF本身就不好出条带，这种分泌型的蛋白很少有用做WB吧
原来我们做的也很不漂亮
CREB应该是没问题的
p-CREB不太好选择
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dreaming[使用道具]
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发表于 2013-11-5 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是个新手，要做你们说的比较难做的BDNF和p-CREB，现在在选抗体，没有人指导，很是无助啊。
我想问个很低级的问题，取的大脑放在﹣80度冰箱中接近一个月，拿出来还可以分离出海马，做western blot 么？
还有关于抗体的问题，一抗二抗可以分开买不同公司的啊？还要自己买内参么？以前理解的是要买抗体就买的是全套，就是包括一抗，二抗，内参，显色剂全套。
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misswu61[使用道具]
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发表于 2013-11-5 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dreaming 于 2013-11-5 22:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我是个新手，要做你们说的比较难做的BDNF和p-CREB，现在在选抗体，没有人指导，很是无助啊。
我想问个很低级的问题，取的大脑放在﹣80度冰箱中接近一个月，拿出来还可以分离出海马，做western blot 么？
还有关于抗体的问题，一抗二抗可 ...

一抗、二抗不同公司都有
内参当然要
整个WB是个系统
需要东西很多，要备齐了
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-11-5 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问你们现在什么做内参啊？
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nn255[使用道具]
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发表于 2013-11-5 22:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是个新手，要做你们说的比较难做的BDNF和p-CREB，现在在选抗体，没有人指导，很是无助啊。
我想问个很低级的问题，取的大脑放在﹣80度冰箱中接近一个月，拿出来还可以分离出海马，做western blot 么？
还有关于抗体的问题，一抗二抗可以分开买不同公司的啊？还要自己买内参么？以前理解的是要买抗体就买的是全套，就是包括一抗，二抗，内参，显色剂全套。

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抗体要买还是买好的，p-CREB可以买cell signalling 的，我自己买的抗体没做出来，用同学的（同一公司同一货号）做出来条带非常好，人品不好啊，郁闷~~~bdnf还在摸索中，等做出来再给你建议吧~ 呵呵~

原则上讲这样取海马是能取出来的，但是有两个问题：
1.当时取大脑是否快速液氮冻存，没有的话估计脑组织都化了，很难将海马取出~
2.即便取出来了，磷酸化的蛋白估计也降解了不少，在这个取海马的过程中还会降解一些，想做好结果就难了~

一抗二抗分开买是可以的
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