【讨论帖】冷冻复性

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标题:【讨论帖】冷冻复性

寻梅[使用道具]
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发表于 2013-11-5 23:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是《冻干法复性蛋白》。冻干法不建议随便做，太耗费能源，如果有生产线资源或者捎带的话，可以尝试一下。对以后大量生产EGF，IGF这种蛋白粗品可能会很有裨益。不过现在正好过冬天，气候干燥的地方可以考虑一下。

protocol很简单，就是变性完了冻结，然后抽取早期融化的液体，其中就应该有已经复性的蛋白。
但是很多蛋白可能对冷冻敏感，这个还需要看您的运气了。具体变性液，我是用8M尿素PBS缓冲液Ph8左右加点BME，加9%甘油做冻结保护剂。您完全可以用您实验室的变性液配方，不必限制。
我做过4种蛋白，其中3种确切获得活性。BSE没条件测活，但是获得水溶性。

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-11-5 23:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由寻梅于 2013-11-5 23:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
是《冻干法复性蛋白》。冻干法不建议随便做，太耗费能源，如果有生产线资源或者捎带的话，可以尝试一下。对以后大量生产EGF，IGF这种蛋白粗品可能会很有裨益。不过现在正好过冬天，气候干燥的地方可以考虑一下。

protocol很简 ...

冰块样品早期融化出来的液体里就没有尿素？

阿司匹林[使用道具]
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发表于 2013-11-5 23:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

请问您做的这四种蛋白是本身就以包涵体形式表达的，还是本身是可溶性，但是加尿素变性？
我希望您提供的方法能对本身就以包涵体形式表达的蛋白质有作用。
如果可能，请贴一张电泳图一饱眼福。（相信有不少人想看图）

bgf5[使用道具]
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发表于 2013-11-5 23:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了上面老师们的讨论真的很钦佩，学生想请教一个问题，我想做二维电泳的实验，但是因为起初不知道，标本取好以后没有用ＰＢＳ液冲洗，没有去除表面的血液，这样血液中高丰度的蛋白质会在胶上将会掩盖有意的蛋白质点。。。现在标本保存在液氮中，不知道怎样处理才能去除这些血液成分？？因为都已经冻在一起了。。。。十分焦急，谢谢帮助。。。

寻梅[使用道具]
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发表于 2013-11-5 23:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最先做成的是自己合成的包涵体，大约250aa（在原公司）；之后一种是某大学的包涵体，其后是RnaseB变性灭活做的（用冻干法）；之后是自己灭活BSE（用复性仪）。
BSE的电泳在复性仪的帖子里有，上面的ladder应该是二硫键尚未氧化的结果，用双氧水氧化后，确实减弱。

另外二维电泳似乎对标本要求不是要命的高，解冻之后洗掉血液似乎就可以了。反正冻在液氮（-196）里面该变性的也都变了……估计你不可能之前做过二甲亚砜防冻处理。

寻梅[使用道具]
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发表于 2013-11-5 23:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

冰块样品早期融化出来的液体里就没有尿素？

============================================================

也会有点的，但是应该不多，所以提到了用预冷的缓冲液稀释一下防止干扰。

uaubc[使用道具]
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发表于 2013-11-5 23:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、相同的包涵体样品做过其他方式的复性试验吗，如透析，稀释，G25换液？
2、蛋白收率如何？除去那一小部分早期融化的液体，余下的主要样品部分怎么办？

个人认为此方法只是利用了变性剂在低温环境下溶解度较低，除去变性剂而已。相同样品如果用这种方法做可以复性的话，那么用稀释法应该也是可以完成复性的。

寻梅[使用道具]
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发表于 2013-11-5 23:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 uaubc 于 2013-11-5 23:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1、相同的包涵体样品做过其他方式的复性试验吗，如透析，稀释，G25换液？
2、蛋白收率如何？除去那一小部分早期融化的液体，余下的主要样品部分怎么办？

个人认为此方法只是利用了变性剂在低温环境下溶解度较低，除去变性剂而已。 ...

相关疾病：
赌博

我做的复性仪能直接析出变性盐而不明显冻结试剂，现实条件不允许……只能这样把最原始的protocol摆在这里让诸位有条件的朋友来尝试，以期先发篇论文之后再找深入研究的机会。
反胶团法收率100%，现在似乎也没用……
科研很多程度上近似赌博……

寻梅[使用道具]
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发表于 2013-11-5 23:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

余下的主要样品部分您可以利用现有的任何方法继续复性，抽出的少许液体基本可以认为对变性液没啥干扰。

寻梅[使用道具]
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发表于 2013-11-5 23:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

发张麻省联系信函的截图，以证所言！

附件

2013-11-5 23:30

39635515.jpg (40.12 KB)

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