小中大例如. 50ug/20ul,做2.5孔, 即50ul,125ug
1 2 3 4
蛋白浓度 10.33 ug/ ul 13.91 ug/ ul 14.87 ug/ ul 19.03 ug/ ul
所需体积 12.1 ul 9 ul 8.4 ul 6.6 ul
5*RSB 10 ul 10 ul 10 ul 10 ul
1* PBS 27.9 ul 31 ul 31.6 ul 33.4 ul
5*RSB: 1.89克 Tris-HCL(PH 6.8), 5克 SDS, 0.125克溴酚蓝, 25ML 甘油.(很粘稠)
Beta-巯基乙醇用时现加,按25%比例.
10* PBS: Nacl 4.25克,Na2HPO4. 12H2O 15.4g, NaH2PO4 2H2O 1.4g, 调PH到7.2-7.4,加ddH2O到500ml
约30分钟左右, 取下梳子,将胶板放入电泳槽内,加入1*电泳缓冲液, 冲洗加样孔. 微量进样器逐个加样,空泳道加入1* RSB. 两胶板之间的电泳液要满. 接好正负极, 开始电泳, 可先小电压,约50V ,大约跑过浓缩胶后再改为100V. 观察MARKER的情况, 适时终止电泳.
建议说目的带要跑到分离胶的2/3处比较好,但本人一直都在上1/3处,结果也还可以.
预染MARKER很重要,开始选了一个国产的,总是跑不好,后来换成NEB的,效果很好,而且也不贵,范围也比较广,把我要的7.,42.17全都包括在内.
如果浓缩胶跑的好的话, 几个孔的蛋白会跑成一条直线.
注意加样时间要尽量短,以免样品扩散,为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液
未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内.
10* 电泳缓冲液: Tris7.58克, 甘氨酸36克, SDS 2.5克, ddH2O定容到250ML.
不好溶,可用搅拌器.
可重复使用,每次加一些新的进去.但本人每次都是配新的,也不麻烦.
转膜:
跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟, 脱色液脱色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何.
另一块可用做转膜. 放入转移缓冲液中摇30分钟左右(有次着急只晃了10分钟,结果也挺好的)。开始用的PVDF膜, 0.45um, 用国产的MARKER后,总是染的不清楚, 而且无论时间长短, 最后一块滤纸都会被染色. 后来换了NEB后,PVDF也不容易上色(可能和PVDF的质量有关,我买的虽然也是MILLIPORE,但好像比较便宜20CM*10CM才50块钱). 丽春红染色也很少能看清条带,后来发现,染色后用甲醇洗,比较容易看出来,但是很难洗掉红色,不知道有没有影响。后来换成NC膜,0.22um ,效果挺好的,MARKER易染上,丽春红也易着色,还一洗就掉。能比较清楚的了解转膜效果。
不同转膜仪和电源转膜的条件不同,我用的是BIO-RAD 的半干转(电压不过25V的那款),电源是BIO-RAD的PC200,70KD的我转50分钟,20V,17KD的转20V,30分钟左右,条件不是很稳定,有时半路打开盖子看看MARKER转的情况,但膜和胶的位置一定不能窜。也有人说用恒流,说1.2-2MA/CM2我看了一下,我的胶大约都是5*3左右大的,20V一般电流会是60-30MA之间,要是这样算的话,最高就30MA, 我不太清楚.
如果用PVDF膜,先用甲醇浸泡一段时间,我一般是5分钟,但也有人说不过30秒,不清楚。换了NC膜就直接放入转移缓冲液中的,晃30分钟左右。
滤纸开始是买的那种专用滤纸,上面三张,下面三张,后来有人说这种滤纸是做湿转用的,应当用那种比较厚的,上下各一张,我也不知道,后来就换成普通滤纸了,上下大约各15张左右,有时着急还反复用过,效果也还可以,估计问题不大。
因为这款半干转膜仪说明书上说不会短路,所以一般滤纸》膜》胶. 他们之间一定不要有气泡.。膜上要做好标记,识别正反面和上下,切个小角是常用的方法, 有MARKER也方便记.
转膜后的胶可用考染看看转膜情况.
考马斯亮蓝R250: R250 0.25克, 甲醇50ML, 冰乙酸40ML, 加水到100ML.
脱色液: 乙酸 50ML, 甲醇225ML(可用乙醇), ddH2O500ML
10*丽春红(20ML): 2%丽春红(0.4克), 30%三氯乙酸(6克), 30%磺基水杨酸(6克). 用时加入9 倍的ddH2O
10*转膜缓冲液:
70KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, SDS 1.85克, 加水到500ML.
用时取10ML, 加20ML 甲醇, 加70ML 双蒸水
17KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, 加水到500ML.
用时取10ML, 加50ML 甲醇, 加40ML 双蒸水