小中大短链脂肪酸(SCFA,short-chain fatty acid)测定
气相色谱法(GC)[35]
(1)标准曲线制作:按表4-3配置不同浓度梯度的乙酸、丙酸和丁酸(也可包括戊酸,己酸,庚酸)标准溶液后进气相色谱分析。用带有火焰离子化检测器和自动进样器的岛津GC2010仪器进行气相色谱分析。分析柱为30m×0.53mm×0.50µm规格的石英毛细管柱(大连,中汇达)游离脂肪酸分析柱(FFAP,free fatty acid phase),载气为氮气,流速为14.4ml/min;测定采用程序升温,初温100℃,保持0.5 min后,以8℃/min的升温速度使最终柱温达到150℃,最终保持1.5min。采用不分流测定方式。进样衬管中置入的玻璃棉,防止样品中颗粒污染物堵塞毛细管柱;监测器(火焰离子化检测器FID)和进样口温度分别为240℃和200℃;氢气、空气和氮气的流速分别为30、300和20 ml/min;进样量为1µL,每个样品运行时间是8.25min。数据处理在HP ChemStation气相色谱工作站中进行。最后以脂肪酸浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,得标准曲线,见图4-1,4-1和4-3。乙酸、丙酸和丁酸的标准混合物的气相色谱分析图见图4-4,其中从左到右分别代表乙酸、丙酸和丁酸标准品在气象色谱分析中的滞留时间。
(3)小鼠粪便样品测定:取0.6g(精确至0.001g)冻结的粪便样品,解冻后悬浮于3ml色谱纯水中,激烈搅拌使粪便均匀分散后静置5min。向粪便匀浆中滴加5mol/L盐酸使其pH降低到2~3。在室温放置10min并间歇摇动。随后将粪便匀浆转移至离心管中,在5000r/min下离心20min。取上清液,并混合一定量的2-乙基丁酸内标溶液(内标的最终浓度保持在1mmol左右)。按照标准溶液分析条件上气相色谱分析。并根据标准曲线计算样品中脂肪酸的含量。