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标题:【求助】原核表达载体构建出大问题了

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-11-8 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】原核表达载体构建出大问题了


各位大侠你们好啊
我最近做原核表达，表达质粒PET-22b，表达宿主菌BL21，我构建完表达质粒后，先转化JM109 ，想再提质粒再转化BL21，进行表达。我做蓝白斑筛选，挑选重组子进行菌液PCR，发现有我的目的条带，而且特别亮。我再咬伤军准备提质粒酶切验证，却发现酶切不正确，我再次从我的菌液里扩目的基因时，却什莫斗扩不出来了！！！！这到底怎么回事？我再把重组质粒进行单酶切验证，发现原来是空质粒！！！没有我的目的基因插入，怎么会这样？我的载体是双酶切的，怎么会成了空质粒了呢？？？请大家赶紧帮帮我吧·！！！！！
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eve_49[使用道具]
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发表于 2013-11-8 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先查一下你的引物在载体中有没有非特异性扩增，其次建议你用连接产物直接转化BL21。
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kswl870[使用道具]
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发表于 2013-11-8 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个太正常了，
首先：蓝白检验，没作control，或者插入片断不是目的片断
其次：PCR检测，假阳性本来就很高，运气不好时，有高达80％的假阳性

建议：
1。 做好control
2。 做好双酶切把。
3。 多找找，多读读以前的帖子，构建载体出的问题多的是，尤其是细节问题。
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发表于 2013-11-8 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对您实验中出现的问题表示同情。

关于克隆鉴定的假阳性，很多帖子中都有讨论。你就是把假阳性当成阳性克隆了，这不是什么大问题。不要乱了方寸。

估计你做菌液PCR的时候用的是基因自身引物？如果那样的话假阳性的几率会比较高。我曾经做过一个，40个菌落个个都有带，当时我就马上用载体引物再做了----几乎是不可能的啊。

pET22b这个载体还是比较好做的，因为载体本身不是特别大。如果你的插入基因达到700 bp左右可以考虑做cracking gel，我一般比较相信
1. 载体上引物的PCR结果；
2. cracking gel的结果，假的特别少；
3. 酶切结果

当然最终你还是要测序的，

祝好运
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发表于 2013-11-8 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这种情况，一看就是假阳性的典型症状！

最好你要测序，测序是最准确的！测序你也可以看出的那些碱基突变了，碱基的多少都会影响你的表达水平！
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greenbee[使用道具]
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发表于 2013-11-8 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再次提醒大家，做阳性克隆坚定需要用一个载体引物和另外一端的特异性引物
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-11-8 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对您实验中出现的问题表示同情。

关于克隆鉴定的假阳性，很多帖子中都有讨论。你就是把假阳性当成阳性克隆了，这不是什么大问题。不要乱了方寸。

估计你做菌液PCR的时候用的是基因自身引物？如果那样的话假阳性的几率会比较高。我曾经做过一个，40个菌落个个都有带，当时我就马上用载体引物再做了----几乎是不可能的啊。

pET22b这个载体还是比较好做的，因为载体本身不是特别大。如果你的插入基因达到700 bp左右可以考虑做cracking gel，我一般比较相信
1. 载体上引物的PCR结果；
2. cracking gel的结果，假的特别少；
3. 酶切结果

当然最终你还是要测序的，

祝好运

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你好，谢谢你的回复，不过我仍然有一个疑问：为甚沫我的竟然是空质粒！！！我的质粒是经过双酶切的呀，按理应该不会自连吧！！！
还有我的转化效率怎么这么低，以前从没遇到过这种情况，几乎都是阴性结果，我都已经转化好多次了！！！
还有就是：直接转化BL21,不是BL21的质粒特别难提出来吗？
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发表于 2013-11-8 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

双酶切的产物中，理论上包含四种片段：双酶切的，每个酶单酶切的以及完全没有被酶切的。它们之间的比例大小，取决于你酶切的效率。如果都是双酶切后的片段，那么你都可以不要鉴定了，直接取菌落提质粒做表达，对不对？但没有谁这么做。

直接转化BL21是不可取的。当然你可以提出质粒来，但效果非常差。如果提质粒用来做转化还行，做别的操作就很困难了。这是因为它的基因型决定的。我们常用的克隆菌如DH5a和TOP10等，是某种内切酶（EcoK I？）缺陷型的，而BL21不是。所以质粒操作还是到克隆菌中吧。
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-11-8 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

直接转化BL21是不可取的。当然你可以提出质粒来，但效果非常差。如果提质粒用来做转化还行，做别的操作就很困难了。这是因为它的基因型决定的。我们常用的克隆菌如DH5a和TOP10等，是某种内切酶（EcoK I？）缺陷型的，而BL21不是。所以质粒操作还是到克隆菌中吧。

你的意思是直接转化JM109，然后鉴定提质粒，再转化入 BL21中进行表达吗？还有就是我的转化效率为什么这么低，以前从没遇到过这种情况。操作都一样呀！没什么不法操作呀！！！
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2013-11-8 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #9 韩梅梅 的帖子

是的，做克隆要用克隆菌，做表达才用BL21

转化效率低跟感受态有关系啊
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