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标题:【求助】免疫沉淀沉淀不完全

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发表于 2013-11-8 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】免疫沉淀沉淀不完全


我做免疫共沉淀，沉淀HSP90发现沉淀很不完全。蛋白大部分还留在上清中，沉淀中的很少。我用的是RIPA裂解液，250ug总蛋白用了2ug抗体，加入抗体后在4度缓慢摇晃24h，后又加入珠子4度缓慢摇晃过夜。请问各位大侠问题在哪里？谢过了先！
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发表于 2013-11-8 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个抗体可以进行IP？
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发表于 2013-11-8 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 NBA 的帖子

可以的，说明书上说可以进行IP
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发表于 2013-11-8 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
沉淀后的检测实验是怎么设计的？
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发表于 2013-11-8 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

沉淀后的上清取出，跑电泳，珠子用RIPA裂解液洗两次后加入适量裂解液及Loadingbuffer，95度煮5min，然后跑电泳，转膜后用HSP90的一抗杂，上清中的蛋白量远比沉淀中的多。不知这样有错没
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发表于 2013-11-8 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

What isotype of your antibody? Did you check the beads fit the antibody isotype or not?
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发表于 2013-11-8 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
What isotype of your antibody? Did you check the beads fit the antibody isotype or not?
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发表于 2013-11-8 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
珠子用哪里的
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wzqzy[使用道具]
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发表于 2013-11-8 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

isotype是rat IgG2a，珠子与它的isotype 是适合的。愁死了，会是什么问题呢？
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bamboo16[使用道具]
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 小中大

Modify the cell lyses buffer as following :

50mM Tris HCl pH 7.5

150 mM NaCl

1% Triton X-100

add proteinase inhibitors freshly
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