气相色谱

准备用酶促荧光法测粪便样品中的D－乳酸含量， 原理：D－乳酸在D－乳酸脱氢酶（D-LDH）的催化下生成丙酮酸，同时把NAD+转变为NADH，NADH具有荧光特性，通过测定NADH 的浓度达到间接测样品中 D－乳酸盐的浓度。已知未去蛋白的样品易受到内源性的L-LDH和D-LDH的干扰，因为NAD+是这两个酶的共同底物。为了避免非特异的NAD+转化成NADH而导致D－乳酸盐浓度的高估，对粪便样品进行前处理非常必要。查文献说，用高氯酸脱蛋白，用量与样品体积比为1：1。

存在疑问：用高氯酸脱蛋白用量应怎么确定？如果用量不足，不足以除去蛋白（内源性酶），如果用量过高，可能对其后加入的酶具有破坏作用，怎样才能确定一个合适的用量，即能保证除去样品中的内源性酶，又不至于影响后来加入用来反应的酶，请各位高手帮忙解决一下这个问题？谢谢！如果不用高氯酸脱蛋白，用其它的试剂也存在同样的问题。

楼主的问题是否属于分子荧光？

应该是分子荧光吧！期待一个合适的答案！

对于除去试样中的蛋白而不影响下步酶的加入，楼主看如下方案是否可行：

1. 直接用乙醇提取乳酸（蛋白不溶于有机溶剂），减压蒸馏（或旋蒸）除去乙醇，用水溶解~
2. 调节待处理的溶液的pH至蛋白酶等电点附近，加热处理使之迅速、完全地沉淀。
3. 凝胶过滤是除去大分子的有效手段，楼主可购买适合该酶分子量的葡聚糖凝胶填料自己装柱进行预处理。

为了不影响将来的酶活测定，用膜过滤除去蛋白也许是个办法。

如果高氯酸用量过高，导致高氯酸过量，你看能否通过检测pH值，用碱来中和过量的高氯酸（这一过程一定要监测pH值，防止碱过量）。

方法的关键：
（1）高氯酸的最终浓度是10%
（2）事后用NaAc调pH至所需。

我没有进行过相似的工作，不能给出权威观点！但理论上，不可行！强酸、强碱和高温都不适合本研究。
建议高氯酸处理后，直接用色谱或质谱方法测定D-乳酸含量。

过量的高氯酸可用碳酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和，然后加乙醇使产生的高氯酸钾（钠）沉淀而除去。

关于高氯酸脱粪便中的蛋白用量怎么确定?

1、 高氯酸与蛋白的作用可生成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。

2、  测定反应比的方法最常用的还是等摩尔连续变化法和摩尔比法。

3、  蛋白一般具有荧光，可向样品中逐滴加入高氯酸测荧光强度，直至荧光消失，确定高氯酸的用量。