小中大【求助】pet-28a，蛋白表达不出来，大大们帮帮忙
小弟最近几个月一直在做原核表达，本打算表达三个蛋白，可就是一个目的蛋白条带都没有出现。相当的郁闷啊。希望各位提一些建议.........
首先从ncbi下载三个基因的cds（从ATG开头到终止密码子）。然后选用新买的pET28a作为载体，设计引物，pcr扩增，跑胶验证都正确。pcr产物纯化（kit），酶切（目的片段、载体），酶切纯化（kit），T4连接酶 16度过夜，取10μL连接产物转DH5a感受态（克隆菌）。接着，挑10个菌落做菌落pcr，进行初步验证，再选择菌落pcr阳性的管，摇菌过夜，提质粒双酶切验证（成功），送公司测序也正确。
测序正确重组质粒再转入表达菌BL21（DE3），挑菌做菌落pcr，菌落pcr阳性的再摇过夜，提质粒双酶切验证（成功），取双酶切验证正确的菌摇过夜，取1ml接种到100mlLB中，od0.4-0.6时添加IPTG，分别取2 4 6 8时段1ml保存。
可是，跑sds-page的时候就是没表达。诱导前后没有特异条带，三个基因都是这样。呕血啊。大大们，帮帮我撒。
后面我又借用别人的PET32a，也进行了上面的实验，结果诱导前后只用表达标签蛋白（20kDa左右），目的蛋白是33kDa左右。
