【求助】WesternBlot求解

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标题:【求助】WesternBlot求解

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发表于 2013-11-9 11:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好，我最近遇到一些关于WB的问题想请教各位：
实验对象为肝癌细胞株，目的蛋白的一抗抗体为abcam公司购买，内参抗体为Tublin，购于碧云天公司，二抗购于碧云天公司，一二抗种属性均一致。
figure 1 target

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2013-11-9 11:08

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小中大

大家好，我最近遇到一些关于WB的问题想请教各位：
实验对象为肝癌细胞株，目的蛋白的一抗抗体为abcam公司购买，内参抗体为Tublin，购于碧云天公司，二抗购于碧云天公司，一二抗种属性均一致。
gene 内参

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2013-11-9 11:08

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发表于 2013-11-9 11:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

figure 2

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小中大

target gene 内参

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小中大

figure 3

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发表于 2013-11-9 11:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

arget gene内参

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发表于 2013-11-9 11:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
电击伤
不好意思，由于点击错误还没编完就给发出去了~~~
figure 4
前排为内参，后排为目的基因
我的问题主要如下：
1、目的基因的抗体说明书显示其大小为67KD，实际做出来的条带位置在55KD左右（如图1、2所示，图1为A细胞株，图2为B细胞株），且条带比较特异，所以请教各位高手我做出的条带是否为目的带？如果是为何会相差这么大？
2、如果是目的条带，我现在重新检测B细胞株中该基因的表达却重复不出来了（如图3、4所示），一二抗比例均同前，上样的蛋白量最低的都>100ng，目的基因表达于胞浆胞核，使用的是碧云天的RAPI强裂解液+cocktail？
3、还有比较纠结的就是每次内参的上样量都不是很一致，我用的是thermo公司的A280nm光吸收法对蛋白浓度进行测定，每次测完浓度后放于-80°保存，上样时都计算了各样本上样量是一致的，我想问的是我所用的蛋白浓度测定方法是不是不合适？WB时使用什么方法测浓度最精准？还有如何防止提取好的蛋白制品不发生降解，是不是提好之后加LOADING BUFFER煮沸再低温保存效果更好？
问题有点多，且刚接触WB技术，提的问题也很肤浅，希望大家多多指教，不胜感激！！！

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发表于 2013-11-9 11:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.实际条带位置和predict不一致很正常,但是你要想确定的话,只有siRNA或者over express或者ip以后再拿另一个antibody probe.
2. 如果是endogenous的蛋白,不同细胞系表达protein量不同很正常.如果是over express的基因,我怀疑你的transfection是不太成功,不同细胞transfection 条件差很多
3.你的protein sample里面要加protease inhibitor的, SDS sample buffer煮过再冻起来也可以,不过定量就麻烦了,我是BCA定量,然后直接冻-20,没有出过问题,要加protease inhibitor, 我用的是sigma的human cell cocktail

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-11-9 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1, 不同细胞蛋白大小有差异并不奇怪。你的是HepG2，但人家说明书上并不见得也是这个细胞。当然，也不能排除这个条带是杂带，抗体不行的可能性（比如你figure1就曝出两条带，上面一条带在figure2里面却没有看到）。
2，重复不出来可能是：A, 样品降解，所以不会保存的话，就最好用新鲜样品。B,上样量不足了（后两个显然没前两个多）C, 人为操作失误（可能性比较小吧）
3，准确定量的问题，要求很高。可以肯定的说，即使那些所谓的“高手”里面也找不出几个能做到定量非常准确的。所以我不可能在这里长篇大论给你细讲。提醒你两个比较关键的步骤：1，浓度测量过程中，尽量降低系统和人为误差。2，尽量降低上样误差（这都跟移液枪有关）。

windboy[使用道具]
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发表于 2013-11-9 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼上两位热心的前辈，小学生受教了，我再仔细找说明书看下看他们做的是哪株细胞，看是否是细胞株不一样，所以存在蛋白大小差异（图1中虽有两条带，但是下方粗点的那个带与图2中是处于同样大小位置，所以我就认为那个是我的目的带了），另外我现在正在拿A细胞株进行重复试验，看能不能做出跟以前一样的条带来。再说到关于上样的问题，因为我的目的基因跟内参大小很接近，所以是分开加样的，如果要比较样本间的表达差异的话，分开加样多少还是会存在人为误差，所以后续可能需要换一个更合适大小的内参。我还想请问janlont的是，一般推荐使用哪种提取蛋白的试剂呢，就像你说的上样量足够这个前提很重要，我目前用的是碧云天的RIPA强裂解液+sigma 的cocktail，我是六孔板冰上直接裂解，感觉每次提取的蛋白浓度都是很低（低的甚至只有8，9ng/ul的样子，不过用的是RIPA中裂解液），裂解液加少了又不好操作，后来自我也改进了方法是胰酶消化收集后换用RIPA强裂解液裂解，间隔涡旋振荡，得率是提高很多，达20ng/ul，虽有提高，但是我的目的基因是表达于胞浆胞核中，裂解45min左右的时候镜下看，胞核还是基本没裂解或不充分，所以我的裂解液是不是也要有所改善?如是。希望你给我们推荐一个更好的提取试剂，再次感谢你们！！！

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