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标题:【求助】疏水层析纯化蛋白不挂柱

wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-11-9 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】疏水层析纯化蛋白不挂柱


我的蛋白是GST融合蛋白，目的蛋白本身很小，只有9kD左右。此样品第一步已经经过GST亲和纯化
用疏水层析第二步纯化蛋白，柱子是SOURCE 15ISO ，起始BUFFER为：50mM磷酸盐缓冲液+2.5M NaCl
全部出现在穿透液中，洗脱至100%ELUTE 20CV以上无峰出现

请教：
1.是否为盐浓度不够导致结合不上？
2.类似此类蛋白，GST标签占较大部分，是否本身结合疏水柱效果就不好？
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-11-9 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用硫酸钠试试。氯化钠的电导较小。
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发表于 2013-11-9 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tuuu2 于 2013-11-9 16:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
用硫酸钠试试。氯化钠的电导较小。

嗯 不过硫酸钠还给买啦 我用硫酸氨看看吧 谢谢帮助啦
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summerxx[使用道具]
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发表于 2013-11-9 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

GST亲和层析纯化后纯度应该就比较高了，为什么还要再疏水纯化啊？
我们做疏水层析的时候盐一般用硫酸铵，二价盐离子强度大，有利于疏水氨基酸的暴露，从而更好的与疏水柱结合。
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发表于 2013-11-9 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

硫酸氨也可以用于疏水纯化，但可能带两个影响，一是可能引成部分蛋白的沉淀，二是在碱性环境下，硫酸氨会释放出氨气。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-11-9 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
GST亲和层析纯化后纯度应该就比较高了，为什么还要再疏水纯化啊？
我们做疏水层析的时候盐一般用硫酸铵，二价盐离子强度大，有利于疏水氨基酸的暴露，从而更好的与疏水柱结合。

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过完GST后，发现目的蛋白附近（5-6kD）左右还存在两个条带，而且量还很多。可能是由于降解什么的原因吧。总之还需要再一步纯化~
现在感觉HIC做最后的精细纯化效果并不好，呵呵~谢谢版主大人回复啦。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-11-9 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
硫酸氨也可以用于疏水纯化，但可能带两个影响，一是可能引成部分蛋白的沉淀，二是在碱性环境下，硫酸氨会释放出氨气。

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噢。。确实是弱碱性环境，氨气的问题没想到，呵呵，果然有经验啊。
沉淀的话我做了个敏感性实验，结果在1.3M的情况下蛋白没沉淀，1.3M硫酸铵，和2.5M氯化钠，感觉差不多啊。。
再次感谢对问题的关注
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发表于 2013-11-9 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
杂带去除了吗？
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-11-9 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 33号 于 2013-11-9 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
杂带去除了吗？

依然不结合~呵呵
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发表于 2013-11-9 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有没有尝试疏水强度不同的柱子呢？或者杂蛋白跟目的蛋白分子量相差一倍以上的，可以考虑用分子筛
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