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标题:【求助】WB,分子量180KD的蛋白的转膜条件？

taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-11-9 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WB,分子量180KD的蛋白的转膜条件？


请问分子量180KD的蛋白用湿法怎么转呢？多少电流或电压？转多长时间？请各位高手指教！
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-11-9 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我以前也是转180kd左右的蛋白，半干转很难
湿转比较好，我是25v恒压转2。5小时
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-11-9 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

绝对不加甲醇，
350mA 1。5小时 BIO－RAD
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uuooii[使用道具]
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发表于 2013-11-9 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教，为什么 不加 甲醇？
我们用300mA，2h,湿转 ，北京六一的，效果不错
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-11-9 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大分子量蛋白不加，因为大家用的膜都是0。46um孔径的，小分子用甲醇效果好。
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mysmdbl[使用道具]
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发表于 2013-11-9 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大分子量蛋白不加，因为大家用的膜都是0。46um孔径的，小分子用甲醇效果好。

==================

请解释的再详细一点.
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-11-9 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

甲醇虽然可以帮助蛋白向膜转移，但是其容易在膜上的微孔上引起还原反应，妨碍大分子蛋白质与膜的结合。
但是SDS可以帮助大分子蛋白向膜转移，故转移缓冲液中可不加甲醇，增加SDS.
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-11-9 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我还担心没人回答呢，多谢各位！
转印缓冲液中不加甲醇的确有道理，我这里也是BIO-RAD的仪器，明天再试试看。
还有一个问题：180KD的蛋白电泳时分离胶用10％，12％，8%的应该都可以吧？我看预染的MARKER都是可以分开的嘛，各位有何见解？
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popo520[使用道具]
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发表于 2013-11-9 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

提高高分子量蛋白转移效果有以下几种方法：
甲醇在其中的作用是增加蛋白与膜结合的能力，可增加转移时间，防止胶变形，但其可降低高分子量蛋白的转移效率，个人认为可适当加10%-15%的甲醇，既增加蛋白的结合，对转移效率影响也不大。
另可加入终浓度0.1%SDS，其可增加转移效率，但与甲醇作用相反，可减少蛋白与膜结合的能力。
总之，你可甲醇和SDS 都适当加点，低浓度，我们一直这么做的，转移200KD左右的蛋白都没问题。
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-11-9 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我按楼上战友说的做礼物，可是仍没有结果，预染MARK最上面一条250KD的也是转上去的，那是怎么回事呢？内参42KD也做出来很亮的，难道是我的抗体失效了吗？
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