小中大六:关于操作问题
1、 装柱
柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂,会被淋洗剂带到产品中的,可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别,只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密(太密了淋洗剂走的太慢),一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来)。书中写的都是不能见到气泡,我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响,一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂,甭管竖的还是横的,都会影响分离效果,甚至作废!
2、 加样
用少量的溶剂溶样品加样,加完后将下面的活塞打开,待溶剂层下降至石英砂面时,再加少量的低极性溶剂,然后再打开活塞,如此两三次,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂,一开始不要加压,等溶样品的溶剂和样品层有一段距离(2~4cm就够了),再加压,这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。
3、 淋洗剂的选择
感觉上要使所需点在rf0.2~0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开,过柱子就用那种极性,如果rf在0.6,即使相差0.2也不容易在柱子上分开,因为柱子是一个多次爬板的状态,可以通过公式的比较:0.6/0.8一次的分离度,肯定不如(0.2/0.3)的三次方或四次方大。
4、 样品的收集
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话,就不容易流出。这样就会发生,后面的点先出,而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。另外,收集的试管大小要以样品量而定,特别是小量样品,如果用大试管,可能一根就收到了三个样品,wuwu。如果都用小试管那工作量又太大。
5、最后的处理
柱分后的产品,由于使用了大量的溶剂,其中的杂质也会累积到产品中,所以如果想送分析,最好用少量的溶剂洗涤一下,因为大部分的杂质是溶在溶剂里的,一洗基本就没了,必要时进行重结晶。
另外,再过柱的时候,有时会出现气泡,一是和使用的溶剂有关,如果是易挥发的溶剂,如乙醚、二氯甲烷等,在室温稍高的情况下,很容易出现这种现象,因此,在室温高的时候,可以选择沸点较高,挥发相对小的溶剂。还有,使用混合溶剂时,使用的两种溶剂的沸点应该相差不大,如:乙酸乙酯和石油醚(60~90),而乙醚却要选择30-60的石油醚。二是:不论是用带砂板的还是塞棉花的,在装柱之前,都要将空气用加压的方法将空气排干,这样就可避免柱中有空气!过柱子需要耐心,不要着急.
极性小的用乙酸乙酯:石油醚系统
极性较大的用甲醇:氯仿系统
极性大的用甲醇:水:正丁醇:醋酸系统
拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸
硅胶柱层析
下面介绍我现在惯用的方法:匀浆法。
1。称量。200-300目硅胶,称30-70倍于上样量;如果极难分,也可以用100倍量的硅胶h。干硅胶的视密度在0.4左右,所以要称40g硅胶,用烧杯量100ml也可以。
2。搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系,就用石油醚拌;如果洗脱剂是氯仿/醇体系,就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆,说明溶剂中含水量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,如果不与水配伍走分配色谱的话,必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥,以除去1%的醇。如果样品对酸敏感,不能用氯仿体系过柱。
3。装柱。将柱底用棉花塞紧,不必用海沙,加入约1/3体积石油醚(氯仿),装上蓄液球,打开柱下活塞,将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降,会有一些硅胶沾在蓄液球内,用石油醚(氯仿)将其冲入柱中。
4。压实。沉降完成后,加入更多的石油醚,用双联球或气泵加压,直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱,都应进行这一步,可使分离度提高很多,且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。
5。上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后,加入一些洗脱剂,再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂,而不会冲坏硅胶表面。
6。过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好,推荐用梯度洗脱。收集的例子:10mg上样量,1g硅胶h,0.5ml收一馏分;1-2g上样量,50g硅胶(200-300目),20-50ml收一馏分。
7。检测。要更多地使用专用喷显剂,如果仅用紫外灯,会损失较多产品,紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。
8。送谱。收集的产品旋干,在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体,可过一小凝胶柱,作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。
1.先根据tlc方法筛选好洗脱剂,使两相邻物质rf值之差最大化
2.将柱子必须装平整、均匀
3.考虑有限柱填料的吸附量
4.可考虑用剃度法分开并洗脱
关于柱子的尺寸,应该是粗长的最好。
柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是
样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二
厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只
有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多
的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,
不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。
现在见到的柱子径高比一般在1:5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体的选
择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2~0.4,杂质
相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm×20cm的柱子
);如果相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也
可以减小淋洗剂的极性等等。
真空液相层析即vacuum liquid chromatography(vlc),即用真空代替压力进行层析,具体方法可见synthesis,2001,no,16,2431-,and j chem edu,1997,10,1222-
干法上样,一般用于固体或粘度大的液体样品。样品用低沸点易溶溶剂溶解,加入1-3倍的粗硅胶,晾干或旋干,干燥的标准是硅胶成细粉而不粘在瓶壁上。装好的柱子上留一段溶剂,把吸附了样品的硅胶慢慢到进去,震动柱子或再加一些溶剂,把粘在柱壁上的硅胶洗下
常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相
的吸附柱。由于柱分的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望
能有所帮助。