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标题:【求助】表达蛋白的奇怪现象

zbboom[使用道具]
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发表于 2013-11-10 21:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】表达蛋白的奇怪现象


最近做一个蛋白的原核表达。表达菌株用的是BL21(DE3)plyss，pET系列的载体，重组质粒转化表达菌株前已经测序没问题。但是诱导后电泳检测和Western blot检测表达情况，发觉诱导表达的蛋白大小和预期相差很远，但是很确定是诱导表达的，并非本底。后来把表达菌株提取质粒送测序，发觉重组质粒目的基因内存在碱基缺失或是插入的情况，连续送了好几个样品去测序，也试过重新转化，但是还是同样的情况。
怎么转化到表达菌株，原本没问题的序列会发生突变呢？！不知道是什么原因导致的，以前还没遇到过这种情况，问老板也说木有见过。。。。。
请大家支招~
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-11-10 21:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这种情况下可能是重组蛋白有毒性或者序列本身不稳定. 可以尝试转化之后加SOC摇一小时，然后不涂板直接加到培养基里摇菌诱导。
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发表于 2013-11-10 21:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 zwsyrt 于 2013-11-10 21:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这种情况下可能是重组蛋白有毒性或者序列本身不稳定. 可以尝试转化之后加SOC摇一小时，然后不涂板直接加到培养基里摇菌诱导。

我们试过在培养基中加入葡萄糖，但是没什么效果。
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发表于 2013-11-10 21:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你PCR的模板有问题吧？先检查下模板
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zbboom[使用道具]
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发表于 2013-11-10 21:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 zwsyrt 于 2013-11-10 21:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这种情况下可能是重组蛋白有毒性或者序列本身不稳定. 可以尝试转化之后加SOC摇一小时，然后不涂板直接加到培养基里摇菌诱导。

我们试过在培养基中加入葡萄糖，但是没什么效果。
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greenbee[使用道具]
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发表于 2013-11-10 21:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“发觉重组质粒目的基因内存在碱基缺失或是插入的情况”这个是什么意思？是同一个质粒中同时存在缺失和插入还是有的缺失有的插入？缺失序列之间、插入的序列之间有共性吗？
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发表于 2013-11-10 21:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 greenbee 于 2013-11-10 21:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

“发觉重组质粒目的基因内存在碱基缺失或是插入的情况”这个是什么意思？是同一个质粒中同时存在缺失和插入还是有的缺失有的插入？缺失序列之间、插入的序列之间有共性吗？ ...

我们测序了多个样品，每个样品都存在缺失或是插入单个的碱基的情况，位置不是确定的。但是其中有好几个样品的结果显示，在同一个位置有一个A的插入，貌似这个位置比较容易产生突变！
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-11-10 21:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

序列不稳定可以考虑换recA-菌株表达, JM109大部分实验室都有, SURE, STBL这些更好但是贵

还有就是葡萄糖对T7表达不能完全抑制，如果怀疑有毒性必须用M9或MDG摇菌然后换含糖培养基诱导。
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zbboom[使用道具]
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发表于 2013-11-10 21:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
JM109应该是克隆菌株吧？可以用于表达吗？
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zbboom[使用道具]
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发表于 2013-11-10 21:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
序列不稳定可以考虑换recA-菌株表达, JM109大部分实验室都有, SURE, STBL这些更好但是贵

还有就是葡萄糖对T7表达不能完全抑制，如果怀疑有毒性必须用M9或MDG摇菌然后换含糖培养基诱导。

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JM109应该是克隆菌株吧？可以用于表达吗？
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