小中大【求助】SDS-PAGE的一些相关问题
我已经跑了快一个月的垂直电泳了,但总是存在这样或那样的问题,现列举出来,还请各位师兄师姐们帮忙.(我们老板说了,如果我在下个月底能把胶跑好了,就请我吃饭,这不是看不起人吗)
我是从手术中获得的关节滑膜组织,置于液氮中冻存,临用前,取约1-2g组织,在液氮下研磨成粉状,然后加2mlPBS(PH7.4),在玻璃匀浆器中以中速匀浆(冰上操作),3000rpm,4度离心15min,收集上清后,用BCA法测蛋白浓度为30mg/ml.然后,用PBS加5倍loading buffer将样品稀释成10ug/ul,在沸水中煮3min ,3000 rpm离心,5分钟,取上清,上样(50,80,100,120,150ug /孔).150-200V电泳约50分钟左右.考染.
采用12%的分离胶和5%的浓缩胶.
结果及问题:
1.溴芬兰不能完全压成一细线
2.溴芬兰各条带不能跑成一水平直线
3.采用六一厂的电泳系统, 在制完胶后,两个玻板之间进气泡,不能完全去除
4.制完分离胶后用水封,胶凝后,胶面不是一个直线,而是略向上鼓起
5.考染后发现两个边孔的条带出现"微笑"
6.各样品之间的条带相互扩散,各跑道不能清楚的分开
7.各跑道宽窄不一,一般是上面窄,越向下越宽,但有时到胶底时又变窄.(是否和玻板与胶之间进了气有关)
8.在各个横向条带中有竖向的条带
9.我在考染前从不固定,直接从电泳中选出胶后扔进染色液中,这样好不好?
10.各浓度之间没有太大差别,是不是我的样品太浓了.另外向我这样从组织匀浆中直接上样电泳行不行,需不需要对样品进行一下处理.
11.我的电泳条带很多,是不是有很多的杂带啊,怎么处理样品才能去杂带?
12.我想问一下我的样品中存在盐浓度太高的问题?怎么才能去盐?
我现在被这些问题困扰着,请大家为我解决一下.多谢!