【求助】求WB高手指点。。。蛋白拖尾。。

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】求WB高手指点。。。蛋白拖尾。。

14 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】求WB高手指点。。。蛋白拖尾。。

minran_1980[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75816
精华 1
积分 339
帖子 293
信誉分 102
可用分 2344
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2013-11-11 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近做WB电泳时老有东西堵在上样口（如图）不过跑上10分钟后上样口的东西又渐渐的看不见了，到分离胶就变得很正常。
也尝试过一些方法如：1、用RIPA稀释蛋白 2、增加losding buffer中SDS的含量 3、加等体积2×的LB ;都解决不了。
不知道问题出在哪里，都有两三个月了都这样。
最近做的是小鼠肝组织蛋白，动物实验重复起来很耗时，希望有好心的WB高手赐教，不胜感激！
RIPA配方：Tritox-100:1%,SDS 0.1%,EDTA 5M,NaCl 150mM,Tris-HCl (PH7.4) 50mM,脱氧胆酸钠 1%。
4*loading buffer:Tris-HCl (PH6.8) 0.2M,SDS 8%,溴酚蓝 0.4%，甘油40%v/v。

附件

2013-11-11 11:16

74849311.snap.jpg (45.22 KB)

dmg[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74197
精华 0
积分 315
帖子 330
信誉分 100
可用分 2457
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态离线

发表于 2013-11-11 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

因为照片上看不太清楚，我怀疑是蛋白浓度太高或者气泡或者是浓缩胶，导致你在操作过程中上样体积不均一，影响最后结果。如果不是的话你的蛋白浓度是多少呢？按照你前面说的用用RIPA稀释蛋白不管用应该不是蛋白浓度的问题。感觉上面RIPA和loading buffer配方也没什么问题，如果蛋白样品的问题请你再仔细观察观察是你上样品之前是没排出上样孔道中的气泡还是梳齿没拔好留了浓缩胶在孔道里导致蛋白拖尾的？

c86v[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77054
精华 0
积分 442
帖子 584
信誉分 100
可用分 3741
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2013-11-11 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果显色后正常，应该就没什么大问题。应该是因为梳齿没拔好留了浓缩胶在上样孔造成的！

bluelake[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76389
精华 0
积分 382
帖子 444
信誉分 100
可用分 3046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态离线

发表于 2013-11-11 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很可能是蛋白质受SDS结合的影响，可改用Tricine-甘氨酸电极缓冲液试试。

7437654[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 107983
精华 0
积分 307
帖子 313
信誉分 100
可用分 2366
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态离线

发表于 2013-11-11 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

样品有沉淀

04906[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 73544
精华 0
积分 599
帖子 858
信誉分 100
可用分 5155
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态离线

发表于 2013-11-11 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该是样品的沉淀，建议每次上样前 4摄氏度离心10分，取上清上样试试。

jiushikeshui371[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108894
精华 1
积分 312
帖子 299
信誉分 102
可用分 2258
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2013-11-11 11:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

样品裂解的时候有沉淀，这种沉淀一般是胶状物，不容易跑下来。
建议裂解完样品以后12000离心10分钟取上清，沉淀弃掉。当然如果你的蛋白如果在沉淀里，可以将沉淀再溶解上样。
其次，配胶的时候可以将浓缩胶多配点，而且拔完梳子，一定记得用注射器或者上样枪将上样孔里吹干净！！

BUK[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74485
精华 0
积分 521
帖子 701
信誉分 100
可用分 4361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态离线

发表于 2013-11-11 11:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加上样缓冲液的样品有沉淀，高速离心，即可解决。

minran_1980[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75816
精华 1
积分 339
帖子 293
信誉分 102
可用分 2344
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2013-11-11 11:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

minran_1980[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75816
精华 1
积分 339
帖子 293
信誉分 102
可用分 2344
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2013-11-11 11:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

样品裂解的时候有沉淀，这种沉淀一般是胶状物，不容易跑下来。
建议裂解完样品以后12000离心10分钟取上清，沉淀弃掉。当然如果你的蛋白如果在沉淀里，可以将沉淀再溶解上样。
其次，配胶的时候可以将浓缩胶多配点，而且拔完梳子，一定记得用注射器或者上样枪将上样孔里吹干净！！

===================================================

那裂解时如何避免沉淀呢，每次上样前都14000rpm离心15分钟。

14 1/2 1 2 ››