蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】我做的wb，投稿后国外编辑的问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】我做的wb，投稿后国外编辑的问题

fqswdzd[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77226
精华 1
积分 295
帖子 285
信誉分 102
可用分 2181
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
1

发表于 2013-11-11 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我做的wb，投稿后国外编辑的问题

我用I型胶原和III型胶原抗体做的western blot 图，GAPDH作为内参，想通过I, III型胶原的降低来证明I型胶原α1My heart单链和III型胶原α1 (III)单链的降低。由于条件所限，我们仅能购买到I型胶原和III型胶原单克隆抗体，未能买到I型胶原α1My heart链、I型胶原α2My heart链和III型胶原α1 (III)链各条前胶原的单克隆抗体，因此无法测得I型胶原α2My heart链的蛋白变化。投稿后已通过一审，下面是二审国外编辑提出的问题，我有点不太明白。请大家帮我分析一下他是什么意思，我该怎么解决。
Therefore entire blots should be presented in the Figures to show the expected, different polypeptide bands. What happens to the alpha 2 My heart chain?
Here again, showing all collagen polypeptide bands present on an entire blot may be more informative and reveal differences between the collagen/procollagen species as newly synthesized species (procollagen) should be more down-regulated than the partially and fully processed (collagen) species.
Blots with antibodies for procollagens were not required, and it seems that there is a misunderstanding because antibodies against collagen I or III will also recognized procollagens I and III. Therefore, showing all collagen polypeptide bands present entire blots would have been more informative.


查看积分策略说明
附件
2013-11-11 16:59
67560437.jpg (78.2 KB)
 
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
2

发表于 2013-11-11 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这三位review的意见很一致呀!按我的理解,他们是想让你提供western胶片的全景,因为他们认为胶原I和III除了你提供的条带外,应该还有一条前胶原I和III的条带,而事实也确实如此,胶原确实存在前胶原形式,即胶原的前体,一般来说,分子量较成体为小,片子上应该在你出示的这条带的上面一点.同一支抗体能检测出胶原及前胶原两种形态.
顶部
fqswdzd[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77226
精华 1
积分 295
帖子 285
信誉分 102
可用分 2181
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
3

发表于 2013-11-11 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先非常谢谢你, 另外:
人皮肤I型和III型胶原分子量都是300kd左右,I型胶原由2条α1My heart链(138kd)和1条α2My heart链(129kd)构成,III型胶原由3条α1(III)链(138kd)构成. 按道理用I, III型胶原抗体可以作出各前胶原单链和胶原链的条带,但由于SDS PAGE电泳只是在分子量7kd-200kd测量结果良好,所以300kd处的条带未能显示.另外我所购买的I型胶原抗体说明书上表明试验结果将在120kd和300kd处各显示1条带, III型胶原抗体说明书上则未作说明.那么这120kd处显示的到底是哪条单链?另外的那种呢? 这些问题试剂商不能给予我明确的答复, 尽管还是国外大公司的试剂, 但国内代理商知识有点欠缺. 我作为初涉实验室的晚辈, 想请教各位高手前辈一下. 谢谢大家.!!
顶部
seagate[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 114508
精华 0
积分 601
帖子 922
信誉分 100
可用分 5343
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
4

发表于 2013-11-11 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我看了一下，我理解的reviewer的意见是：你贴的图分别检测的是I胶原和III胶原。
但他认为你应该在一张片子上同时提供蛋白亚基（ polypeptide bands即a1和a2两条链）的表达条带，而不是I型胶原和III型胶原。

我给你这样分析：使用还原型的SDS－PAGE，打开蛋白亚基，行western blot，检测的条带是a1和a2两条带（也可能包括前体）
不过根据你的叙述，你并没有检测I型和III型胶原，你只是检测了他们的a1和a2亚基而已。那么你上样缓冲液有无还原剂DTT（二硫苏糖醇）或者2巯基乙醇？有这两个肯定会打开巯基，使亚基分开，检测不到组装蛋白。

western的抗体一般都是线性表位，必定针对某段AA序列。根据你提供的胶原构成，III型胶原仅由a1构成，那么抗体肯定是针对a1链的表位。I型胶原的抗体肯定不识别III型胶原，则抗体一定是针对a2链的。一个方法可以明确抗体的性质：看说明书上（或者向公司询问）抗体针对的表位AA序列，与亚基AA序列比对一下就知道用的是那条肽链上的序列去免疫动物获得抗体的了。

或者你拿同一张膜分别先后用两个抗体去做western，比对一下目的蛋白的位置也可以勉强确认（138和129相差很小，所以要细心了，8％左右的胶比较合适）
顶部
gmjghh[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75184
精华 0
积分 475
帖子 589
信誉分 100
可用分 3823
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
5

发表于 2013-11-11 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在也在做I型胶原和III型胶原的wb,一抗是abcam的，上清和细胞的都做了，但是总是出不来条带，。用的是韧带细胞ACL和mcl，总蛋白都达到200mg了，请各位帮帮忙分析一下原因。同条件下另一蛋白250KD的都出来了
顶部
tianmei001[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73832
精华 1
积分 585
帖子 806
信誉分 102
可用分 4823
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-28
状态 离线
6

发表于 2013-11-11 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下你的col1和3的抗体是哪家公司的，能提供一下具体的货号吗？

我们做的wb用的col的抗体总是不好，得用很高的浓度，出的条带也不好。

非常感谢！
顶部
jiushikeshui371[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108894
精华 1
积分 312
帖子 299
信誉分 102
可用分 2258
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
7

发表于 2013-11-11 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你做的col1 的具体的实验条件是什么啊 比如说是否是非变性的胶等等 谢谢 我做的老是出不来条带 非常感谢 急急急急！！！！
顶部