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标题:【求助】一个蛋白质组学实验设计问题

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发表于 2013-11-11 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】一个蛋白质组学实验设计问题


我想比较两个样本差异表达的蛋白质,一些文献上多用银染分析,考染取点进行质谱鉴定.请问各位大侠,可不可以直接用考染做差异点分析(窄pH范围胶条),省去银染步骤?多谢!
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2013-11-11 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般说用2Ｄ是可以的，但考染比银染的灵敏度差，然而它的步骤比银染简单，你可以先试试，看能不能区分开差异蛋白。如果pH值窄，你可以跑电泳时间长一点。
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idoww[使用道具]
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发表于 2013-11-11 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这没有什么可不可以,只是考染的灵敏度远低于银染(银染为ng级,而考染为几十ng-1ug),您往往在考染中上1mg以上的量所获得的蛋白质斑点的数量还不及银染100ug多,如果您需要的是表达量比较低的蛋白质而考染的灵敏度达不到的话,银染是一个不可回避的步骤.当然,如果您拥有荧光扫描仪等设备的话,使用sypro ruby也是一个相当不错的选择(灵敏度接近银染并与质谱兼容),此外,DIGE技术从很大程度上减少了凝胶间差异给匹配带来的影响.当然,理论上是这样,具体操作起来还有许多值得注意的地方.
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nikun230[使用道具]
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发表于 2013-11-11 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

能不能推荐一个质谱兼容的银染方案。谢谢！
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2013-11-11 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实银染时不要使蛋白质氧化,不使用交联剂如戊二醛就可以基本与质谱兼容.下面推荐欧洲分子生物学实验室方法(EMBL):该方法的质谱兼容性在银染中算比较高的.肽段的序列覆盖率以及灵敏度都不错,不过背景比较黑,如果固定过夜估计会好一些
EMBL Silver staining
Buffers
Fixer: 50% MeOH, 5% HAc vol. 200 ml.
100 ml MeOH Merck 1.06009
10 ml HAc (100%) Merck 1.00063
90 ml H2O MilliQ
Wash: 50% MeOH vol. 200 ml.
100 ml MeOH
100 ml H2O
Sensitizing: 0.02% Na2S2O3 vol. 200 ml.
0.04 g. Na2S2O3 Fluka 72049
200 ml H2O
Silver nitrate: 0.1% AgNO3 Vol. 200 ml. (Cold)
0.2 g AgNO3 Sigma S-8157
200 ml. H2O
Developer: 0.04% Formalin, 2% Na2CO3 Vol. 250 ml.
100 µl Formalin (35% Formaldehyde) Merck 1.04001
5 g Na2CO3 Merck 1.06392
250 ml. H2O
5% HAc: 5% HAc Vol. 200 ml.
10 ml HAc (100%)
190 ml H2O
Procedure
1. Fix gel: 50% MeOH, 5% HAc for 20 mins.
2. Wash gel: 50% MeOH for 10 mins.
3. Wash gel: H2O for 2 hrs.
Reduce background staining by over night washing.
4. Sensitize gel: 0.02% Na2S2O3 for 1 min.
5. Wash gel: H2O for 1 min.
6. Wash gel: H2O for 1 min.
7. Incubate gel: Cold 0.1% AgNO3 for 20 mins. at 4oC
8. Wash gel: H2O for 1 min.
9. Change gel chamber
10. Wash the gel: H2O for 1 min.
11. Develop gel: 0.04% Formalin, 2% Na2CO3
Observe the color and change solution when the developer turns yellow. Terminate when the staining is sufficient.
12. Termination: 5% Hac
Change the solution a couple of times
13. Leave the gel at 4oC in: 1% HAc
此外目前各大实验室最常用的方法(军事医学科学院常用的),2000年电泳杂志上推荐的方法,也是AMERSHAM试剂盒和标准protocol上所载的方法,可以在AMERSHAM的手册上面查到,也是与质谱兼容的.
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发表于 2013-11-11 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于兼容性再发一贴，以表我对丁香园的支持，也希望大家群策群力，共同交流。

染色方法与质谱分析的兼容性[4]

1.传统的染色方法
在蛋白质组学领域中广泛应用的是考马斯亮蓝染色法和银染法。考马斯亮蓝染色法较为灵敏，可以达到微克级检测水平；符合线性动力学，非常适合定量，这一点相当重要；易于使用并且与质谱分析的兼容性相当出色，这些都使得它成为常规染色的首选。不幸的是，微克级的检测水平使它无法检测到相当多的低丰度蛋白质，日益成为蛋白质组学的瓶颈。

银染法比考马斯亮蓝染色法灵敏约100倍，检测限度可达纳克级水平，被广泛应用于各蛋白质组学实验室，但是并非完全符合线性的动力学（仅在约100～150ng范围内），导致蛋白质差异显示的不准确性，给后续分析及鉴定带来一定的实际困难，实验操作中使用的银离子及戊二醛影响胶内蛋白质酶解，降低了蛋白质质谱分析的氨基酸序列覆盖率。

常规实验室蛋白质（考染）鉴定的成功率在60％～80％之间，远高于蛋白质（银染）鉴定的成功率（约为30％～60％），鉴于此，我们也在不断发展新的方法，以提高银染鉴定的成功率，改进的无戊二醛银染法[5]和H2O2[6]脱色法将会降低不利因素带来的影响。

2.荧光染色法[7,8]
虽然荧光染色应用到蛋白质组学实验中时间不长，但其突出的优点和广泛的应用前景强烈冲击着传统的染色方法，从事蛋白质组学实验的研究人员将是最大的受益者。荧光染料有多种，其中以Sypro染料最为引人注目，荧光染色法与银染法同样具有高灵敏度，但克服了银染法的一些缺点，染料与蛋白质非共价结合，减少了对酶解及质谱分析的影响，极大地提高了氨基酸序列覆盖率，同时符合宽广的线性动力学范围（2～2000ng），这使得低丰度蛋白质的检测和精确的蛋白质定量更为准确、简便。但是由于荧光染色法要求使用昂贵的仪器和试剂，目前限制了它在蛋白质组学中的广泛使用，十分遗憾。

科学无国界，交流无“大小”，——
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2013-11-11 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上同志的提醒!荧光染色除灵敏度接近于银染并与质谱的兼容性较高之外,还有一个特性就是其上佳的线性范围。好象以前在哪里看的一篇文献还报道过荧光染料的线性范围接近４个magnitude。荧光染色也有自己的弱点：荧光染剂颗粒会影响图象分析；荧光染色后的胶很脆，易碎（偶的一张２４cm凝胶曾经被偶五马分尸，呵呵）；此外就是楼上兄所说的代价高昂。
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发表于 2013-11-11 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

介绍几个改良考染和质谱兼容的银染
1 Neuhoff胶体考染法
[1]固定：12%（W/V）三氯醋酸（TCA）2h
[2]染色：200ML染色液混合50ML甲醇 16-24h（染色液：在490ML含2%的H3PO4中加入50G（NH4）2SO4直至完全溶解，再加0.5gCBBG250搅拌混合，定容至500ML使用前摇匀）
[3]漂洗0.1mol/L Tris-H3PO4(PH6.5)漂洗两分钟；25%甲醇漂洗不超过1分钟
[4]稳定：在20%的（NH4）2SO4中稳定蛋白质-染料复合物。
优点：背景低，灵敏度高，可达200ng protein/spot

2热考马斯亮蓝染色及二次染色法
[1]染色 （0.025%考马斯亮蓝R350）：将1片PHast Gel Blue药片溶入1.6L 10%醋酸，将染色液加热到90摄氏度倒入凝胶染色盘，振荡10分钟
[2]脱色：10%醋酸室温振荡脱色2小时，期间需多次更换脱色液，脱色液可通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收
优点：脱色液和染色液可重复使用，灵敏度较经典考染高

二次染色
等待考染后的背景完全脱除后，可以用以下的银染法进行二次染色。因为蛋白点已经经过固定，可以直接从敏化步骤开始

兼容质朴的银染法
1固定 25ML acetic acid, 100ML methanol ,125ML 15min 2次
2敏化 75ML methanol ,0.5g Na2S2O3,17g NaAC,milli-Qwater to 250ml 30min
3漂洗250ml milli-Qwater 5min 3次
4银染 0.625gAgNO3,milli-Q water to 250ml 20min
5漂洗 milli-Q water 1min 2次
6显色 6.25g Na2CO3,100ul formaldehyde,milli-Q water to 250ml 4min
7终止 3.65g EDTA,milli-Qwater to 250ml 10min
8漂洗250 milli-Qwater 5min 3次
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2013-11-11 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
兼容质朴的银染法
1固定 25ML acetic acid, 100ML methanol ,125ML 15min 2次
2敏化 75ML methanol ,0.5g Na2S2O3,17g NaAC,milli-Qwater to 250ml 30min
3漂洗250ml milli-Qwater 5min 3次
4银染 0.625gAgNO3,milli-Q water to 250ml 20min
5漂洗 milli-Q water 1min 2次
6显色 6.25g Na2CO3,100ul formaldehyde,milli-Q water to 250ml 4min
7终止 3.65g EDTA,milli-Qwater to 250ml 10min
8漂洗250 milli-Qwater 5min 3次

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这就是我说的"此外目前各大实验室最常用的方法(军事医学科学院常用的),2000年电泳杂志上推荐的方法,也是AMERSHAM试剂盒和标准protocol上所载的方法,可以在AMERSHAM的手册上面查到,也是与质谱兼容的."呵呵,谢谢老兄贴出来!
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lixi559[使用道具]
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发表于 2013-11-11 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用此方法找出差异蛋白之后，下一步该做什么呢？
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