【讨论帖】大家就跑胶时的细节,如电压,PH,离子浓度,溴芬兰

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标题:【讨论帖】大家就跑胶时的细节,如电压,PH,离子浓度,溴芬兰

米囡[使用道具]
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发表于 2013-11-15 21:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很多新战友在SDS-PAGE时发现溴芬兰不能压成一条线,很弥散,就着急,生怕电泳跑不好,其实暴光出来条带还是很漂亮的.

那么电泳时溴芬兰形态和什么有关系呢?大家可以讨论讨论,
先看一个图

这是刚电泳不久的图片,大概6,7min的时候,
我们看到溴芬兰条带压的挺整齐的,
但是第一个marker孔还是弥散,

样品是用TCA沉淀的,溶解的buffer主要成分是:8M urea, 10mM DTT, 20mM Tris, 23mM Glycine, ph 8.8
这是fermenta的一个中分子量marker, 主要含62mM Tris( ph7.5), 1mM EDTA, 2%sds, 10mM DTT,1.5mM NaN3,33%GLYCEROL. 用相同的 buffer补齐体积.

所以样品及上样缓冲液的离子浓度和ph值对溴芬兰条带的影响是很大的.

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2013-11-15 21:22

33146996.snap.jpg (25.86 KB)

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发表于 2013-11-15 21:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是同时跑的另外一块胶,
我们看到溴芬兰还是挺整齐的,但是条带压的不如第一块胶紧,
所有的上样buffer都一样,两块都是连续胶,都没有积压胶只有分离胶,都是12%的

唯一的区别是第一块胶里加了40%甘油

有时候在NATIVE-PAGE里会加甘油,或是区分有些磷酸化和未磷酸化蛋白时的glycerol-urea PAGE时,
甘油的存在主要是为了使一定电荷差异的,如相差了一个磷酸基团的蛋白,分辨率更好,

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2013-11-15 21:23

28884774.snap.jpg (27.04 KB)

米囡[使用道具]
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发表于 2013-11-15 21:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是跑到后来的形状, 都压成一条线了
以前有讨论,说溴芬兰弥散压的不齐使因为浓缩胶不够长,PH不对,或电泳缓冲液陈旧,我觉得都不是这些问题.

这次电泳的缓冲液已经是第四次用了,
缓冲液旧了,相同电压下,起始电流大,但是随着电泳的进行,电流下降的幅度也大,缓冲能力减弱
我喜欢用旧的缓冲液,因为每次用新配的,起始电流只有五十几mA,而旧的有八十几,甚至一百十几mA,(我用的是300V的电压),而终末电流都差不多,11或12mA.

因为第一块胶里加了甘油,所以电阻比第二块胶大许多,我们知道,电泳时两块胶是并联的,电压一样,所以第二块胶的电流大,溴芬兰条带跑的比第一块胶快.

在第一块胶里,因为离子浓度不一样,
所以marker已经在挤压旁边的甬道.marker跑的比较宽

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2013-11-15 21:24

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发表于 2013-11-15 21:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

好像如果上样体积不一样的话，marker会被压得快些，可以补充些上样缓冲液，压的线就比较平。可以试试。我也遇到这样的情况，上样体积差异大会有影响的

greenbee[使用道具]
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发表于 2013-11-15 21:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上样体积要一致，样品稀释后的PH值要一样，不然溴芬兰也会变形，浓缩胶不能太短，否则压不成直线，上样体积不能太大，否则浓缩不好，溴芬兰也会比较宽，配胶的tris-Hcl PH值要准，不然溴芬兰也会压不平，越跑越弥散，样品注入的时候要小心注入到底部，弄好了就要电泳，不要等太久了，不然会弥散。

abc816[使用道具]
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发表于 2013-11-15 21:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

虽然很少出现溴芬兰变形的情况，但还是要谢谢iris的图文总结以及xiaohua62003和cake2003两位战友的经验分享，受益匪浅啊。

nikun230[使用道具]
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发表于 2013-11-15 21:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

恩，楼上说得很有道理啊~
前段时间溴芬兰老是跑得很弥散，重新配了Tris-HCl之后，果然好多了~

idea2011[使用道具]
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发表于 2013-11-15 21:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上样体积要一致，样品稀释后的PH值要一样，不然溴芬兰也会变形，浓缩胶不能太短，否则压不成直线，上样体积不能太大，否则浓缩不好，溴芬兰也会比较宽，配胶的tris-Hcl PH值要准，不然溴芬兰也会压不平，越跑越弥散，样品注入的时候要小心注入到底部，弄好了就要电泳，不要等太久了，不然会弥散。

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总结下自己做过的电泳,我觉得样品及上样缓冲液的离子浓度和PH值最重要了,
跑SDS-PAGE 的时候往往溴芬兰会迷糊,压的远不如这两张图好看,\
上样体积是其次的,因为我同时试过40ul和20ul 的上样,都压很好,粗细有别而已.
浓缩胶也撇开不说,因为不用浓缩胶也压的很好.
至于配胶的tris-Hcl PH值,曾经因为有个师哥溴芬兰条带压不好,而隔壁实验室压的比他好,我们借过隔壁的Tris,但是发现他们Tris的PH值还没有我们的准确.

除此之外,胶也有关系,比如加了甘油之后,同样的条件,压的更紧些.

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发表于 2013-11-15 21:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

顺便讨论一下，溴芬兰和电压有没有关系？看到iris用300V的电压，吓了一跳，电压太高会不会散热不行？好像是电压越高，样品的分辨率越高，是不是越高越好（在散热可以的情况下）？和目的蛋白大小的关系是什么？昨晚就查了《蛋白质技术手册》和《蛋白质电泳指南》，都没有答案

seagate[使用道具]
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发表于 2013-11-15 21:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的样品在浓缩胶里都没跑两下溴酚蓝就散开了，根本看不到一条一条泳道呀，不过结果也不错。可是这几次跑到分离胶（12％）接近底部时就歪了，很难看，甚至有一次结果每条带（22kD）都呈大雁样。郁闷，改用15％胶又好一点。不知什么原因。有人说是电压太高，95v和135V，一块胶电流只有20mA左右，跑得非常慢，好像又不太像这个原因

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