【求助】Western-Blot 实验条件摸索问题

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标题:【求助】Western-Blot 实验条件摸索问题

sr9971[使用道具]
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发表于 2013-11-15 22:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Western-Blot实验条件：

1.制胶：浓缩胶 4% 分离胶 8%

2.蛋白变性和上样： 5×SDS上样缓冲液：样品=10μl:40μl=1:4
PCR仪：100℃ 5min
上样量:20μg

3.电泳：浓缩胶 50v 分离胶 100v

4.转膜：恒流19mA（根据PVDF膜的长宽计算得来的 0.8mA/cm2 ） 1.5h

5.封闭：5%封闭液（牛奶+TBST）封闭2h

6.免疫反应：

一抗：

NOD1: 羊抗2μl：5%封闭液 500μl=1:250
β-actin: 兔抗2μl：5%封闭液 500μl=1:500
4℃过夜（第二天37℃回温0.5h）
TBST 10min/次 2次； TBS 10min/次 1次.

二抗：
NOD1: 兔抗山羊0.5μl：TBST 4ml=1:8000
β-actin: 山羊抗兔0.5μl：TBST 4ml=1:8000
37℃ 孵育45min
TBST 10min/次 2次； TBS 10min/次 1次.

7.曝光凝胶成像仪

说明：我们要测的蛋白是细胞膜蛋白：NOD1 95kd
样品：正常—正常+接菌—免疫—免疫+接菌
（上样量：30μg即8个孔中，前4个和后4个对应）
结果：上面的图为目的基因NOD1，下面的为β-actin.

问题:
1.条件都没改变，可是近日就是不能重现原先的结果。目的条带就是出不来，可是内参有时却很漂亮。做了好几次，也不知道原因在哪里，我应该从那几个条件逐步改动呢？
2.如果曝光后条带周围有深浅不一的背景或是有点条带没有曝出来时，我会讲膜放到TBS中涮洗几下重新加AB液，这样的操作有时候会使结果有所改善，比如条带清晰了或是之前没曝出来的条带此次出来了。这样的话结果不是经常会变得，人为的操作影响因素好大，结果好不稳定哦!而且AB液滴加的量对结果影响真的很大。

左图：NOD1-Actin: 正常--正接—免疫-IPA
之前做的几次结果和这个差不多

右图：近日做的结果

附件

2013-11-15 22:17

99075572.snap.jpg (26.36 KB)

莲花白[使用道具]
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发表于 2013-11-15 22:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 sr9971 于 2013-11-15 22:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
Western-Blot实验条件：

1.制胶：浓缩胶 4% 分离胶 8%

2.蛋白变性和上样： 5×SDS上样缓冲液：样品=10μl:40μl=1:4
PCR仪：100℃ 5min
上样量:20μg

3.电泳：浓缩胶 50v 分离胶 100v

4.转膜：恒流19mA（根据PVDF膜的长宽计算 ...

建议找找一抗的原因

mingming0638[使用道具]
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发表于 2013-11-15 22:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一抗的效价是主要原因，1：250稀释的抗体应该是国产的吧？可能不稳定，步骤没有问题。/

eric930[使用道具]
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发表于 2013-11-15 22:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

western基本不用摸条件，已经是很成熟的试验方法了，一要蛋白样品好，二要一抗好。

ffooll[使用道具]
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发表于 2013-11-15 22:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

问题1. 考虑下抗体效价下降的因素吧，你用的还是原来的那管抗体吗？抗体是否有保存妥当？因为即使是国外一些大公司的产品，批次间的差别有时候还是比较大；抗体没有保存好的话，效价下降也是经常发生的事情。另外，冬天气温比较低，可能需要适当延长下抗体的孵育时间。
问题2，以前这样折腾过，可是最好第一次曝光后最好是TBS-T洗几次，比如5min*3，以去除在二抗附近的反应底物。如果你注意看的话，有时候加了反应底物后，膜上能明显看到黄色的荧光条带，尤其是在信号比较强的状况下。还有如果是周围条带背景比较多的状况的话，说明有非特异性结合，如果想通过洗膜的方式降低背景的话，TBS-T洗膜的时间可以更长些。

sr9971[使用道具]
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发表于 2013-11-15 22:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位的解答
我的一抗一直用的一种。从北京中杉买的Santa scruz的抗体一直放在4℃冰箱，加抗体的时候拿出来一下。如果是一抗的效价问题的话，我除了延长抗体孵育时间，是不是可以增加一下一抗的浓度。还有就是，NOD1我做的这个蛋白本身的表达量好像就很低，这样如何处理呢？

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发表于 2013-11-15 22:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

简单，你能增加上样蛋白总量吗？现在做不出，你应该至少加到40－80 ug

如果样品过于珍贵，不能再增加了，就换成超敏的发光液。

还有可以考虑更换抗体，你现在用的什么牌子的抗体？我不建议再增加稀释比例了，1：250已经很高了。最多你在一抗过夜的时候，多放一些抗体。你现在是500 ul，可以试试2－3ml（还是1：250稀释）

santa的？还是国产分装的？如果目的蛋白非常关键，试了以上的方法都不行，就狠心买一管cell signal的抗体。他家的抗体没话说，santa的差强人意，而且也不便宜。

还有，几个小小建议：
1。蛋白定量要再加强，你的actin差异比较大的。好好做蛋白定量
2. 电泳跑的太快了。你看看actin都歪了，我建议你跑电泳的时候最好有点耐心，索性80 V从头跑到尾，你会发现，条带会很直。

sr9971[使用道具]
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发表于 2013-11-15 22:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢你的建议和指教！
1.上样量：我提的是细胞膜蛋白，6孔板的密度2×105，因为还要给细胞抑制剂，所以对细胞密度也是有要求的，增加上样量有点难度。

2.发光液：请问超敏发光液都有哪些啊？

3.抗体：我们用的是santa cruz的一抗

4.电泳：actin 条带歪了我不知道是不是因为转膜的时候胶放歪了造成的，还是你说的电泳的条件不好，因为之前师姐做其他的蛋白用的这个条件，actin跑出来很漂亮。还有就是因为每个孔之间的上样量有差别的，有的上样量大，孔道都被压变形了，我想这是不是也是因为actin跑歪的原因呢？请多指教。

5.边缘菲特异性条带：我后期用的另外一批蛋白做，上样量达到30μg,其他条件没有变动。有条带出来，但是有两条带。按理是目的条带NOD1应该是下面一条带，可是只出来了几个样本的而且很淡。我共上了9个样。反而上面那条带那么清楚，是非特异条带还是边缘胶带呢？（如图所示）

附件

2013-11-15 22:20

94938432.snap.jpg (19.37 KB)

sr9971[使用道具]
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发表于 2013-11-15 22:21 资料个人空间短消息加为好友

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ffaa[使用道具]
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发表于 2013-11-15 22:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一抗放在4度冰箱效价损失比较快吧，个人觉得。当然这是我亲自试验过的……

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