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标题:【求助】肠激酶酶切后出现规律的非特异条带

iii_ii[使用道具]
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发表于 2013-11-15 22:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】肠激酶酶切后出现规律的非特异条带


从左往右，1：样品蛋白酶切3小时
2：5小时；3: 7小时；4：9小时 温度26，NOVAGEN的rEK，酶与蛋白比例大概为1单位：30微克。
5：未切的样品蛋白 23KD左右
6：MARK12，最下面应该是2.5和3.5，没有明显跑开，依次为6，14.4，21.5，31
7：基本同1-4 ，酶与蛋白比例大概为1单位：75微克。

此样品蛋白为融合蛋白，23KD,经过NI柱后可以看到目的蛋白比较干净，理论上酶切后应该有两条带，分别是17.5KD和5.5KD。但是非特异条带很多。另外，用肠激酶附带的对照蛋白尝试切割，结果没有非特异性，比较郁闷。请大家帮忙分析一下！


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2013-11-15 22:53
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发表于 2013-11-15 22:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师:
您用的是PET32载体吧,您的表达载体上应该还含有trombin酶切的位点,EK会非特异性的切割trombin,您Tricine胶14.4-21.5之间的那个酶切后的粗带应该是trx标签,下面的那条带应该是您的目的多肽,在Trx标签和融合蛋白之间的两条细带应该是非特异性切割trombin后产生的标签条带.您可做western鉴定下.
当然也不排除您的目的蛋白降解,不过从您的胶上,觉得这个可能性不大
祝实验顺利!
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发表于 2013-11-15 22:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lorri 于 2013-11-15 22:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

老师:
您用的是PET32载体吧,您的表达载体上应该还含有trombin酶切的位点,EK会非特异性的切割trombin,您Tricine胶14.4-21.5之间的那个酶切后的粗带应该是trx标签,下面的那条带应该是您的目的多肽,在Trx标签和融合蛋 ...

您好，
首先，您太客气了，我是新手，不是老师。看得出您很专业，我用的确实是PET32。但是，如果在trombin酶切位点切开，应该有15KD和8KD两条带，从大小看显然不是中间那两条。另外，Trx标签我认为是那条粗带，但是我找不到目的蛋白，因为目的蛋白大小是5.5KD，下面那条似乎不太可能是。
我用另外一种肠激酶又切了一次，有结果马上发上来。
再次感谢您的指导。
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发表于 2013-11-15 22:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分析可能的原因:
1，酶用量过高
2，酶切时间不合适
3，酶切温度过高（蛋白不稳定），可在4度下酶切


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发表于 2013-11-15 22:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
头痛
大家好，已经换过肠激酶，非特异条带仍然呈现规律性。很头疼，望大家指导！另外上图中在8KD位置隐约有条带。


我的酶切做了时间和量的梯度，从结果看，前两点的可能不大。另外我的酶切温度为17度左右，按别人的经验来看，降解的可能也不大。

我现在怀疑酶切的量还是太小，目的蛋白看不出来，但是非特异条带无法解释。
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发表于 2013-11-15 22:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知你的酶切体系是什么？记得体系中盐离子强度高了会影响其活性。我记得以前做过的实验半小时就切了一半，活力很强。
在含有过量的Urea(>2M),NaCl(>250mM),ß-BE(>20mM),SDS(>0.1%),imidazole(>50mM)等,以及在PH>-或PH<6的缓冲体系条件下酶切,都将影响Enterokinase的正常活性.
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发表于 2013-11-15 22:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，
首先，您太客气了，我是新手，不是老师。看得出您很专业，我用的确实是PET32。但是，如果在trombin酶切位点切开，应该有15KD和8KD两条带，从大小看显然不是中间那两条。另外，Trx标签我认为是那条粗带，但是我找不到目的蛋白，因为目的蛋白大小是5.5KD，下面那条似乎不太可能是。
我用另外一种肠激酶又切了一次，有结果马上发上来。
再次感谢您的指导。

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您好!
我个人的建议:
1.western鉴定下,哪个是标签,应该是我说的那条带;
2.加大酶量,确保酶切完全彻底,[跑胶的时候加大上样量,因为小肽跑PAGE胶,容易弥散,需要ug以上的量才能看见;
3.个人觉得有时跑胶,marker只是做为参照,实际上您的目的蛋白的分子量不一定就出现在您和marker相应的位置,有时会有点偏差,如果您不好判断的话,可大量酶切一次(现在EK都很便宜的啊),然后过镍柱,收集流出液,跑电泳看看是哪条带,理论上流出的蛋白应该是您融合蛋白酶切后的目的蛋白.
祝好运!
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 小中大
做一个没有酶的阴性对照啊，可以看出是否是降解造成的。至于分子量大小，可以加一个已知蛋白，比如溶菌酶之类，可以大概有个比较。
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发表于 2013-11-15 22:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Trx有非特异性切割，请见文献，可看他们相关工作
Protein Expr Purif. 2005 Jun;41(2):332-40.
Preparation of recombinant thioredoxin fused N-terminal proCNP: Analysis of enterokinase cleavage products reveals new enterokinase cleavage sites.
Liew OW, Ching Chong JP, Yandle TG, Brennan SO.
C-type natriuretic peptide (CNP) acts as a paracrine hormone to dilate blood vessels and is also required for the growth of long bones. In vivo, CNP is produced by cleavage from the C-terminal end of a larger proCNP peptide. The remaining N-terminal proCNP fragment (NT-proCNP) escapes into the circulation where its concentration is much higher than that of CNP due presumably to a lower clearance rate. Our strategy to obtain large quantities of pure NT-proCNP for further physiological investigations was to express it as a fusion protein with HisDevil-tagged thioredoxin followed by cleavage using enterokinase to yield NT-proCNP alone. We have successfully designed and artificially synthesized the coding sequence specifying both mouse and human NT-proCNP with built-in codon bias towards Escherichia coli codon preference. An enterokinase recognition sequence was incorporated immediately upstream of the NT-proCNP coding sequence to allow the fusion protein to be cleaved without leaving any extra residues on the NT-proCNP peptide. High levels of fusion proteins were obtained, constituting 50-58% of total bacterial proteins. Greater than 90% of recombinant thioredoxin/NT-proCNP was expressed in the soluble form and purified to near homogeneity in a single chromatographic step using nickel as the metal ion in IMAC. A time course analysis of the products released from enterokinase cleavage of the recombinant proteins by ESI-MS revealed three sensitive secondary cleavage sites: two were located on vector-associated sequences linking the thioredoxin moiety and NT-proCNP, and one at the C-terminal end of NT-proCNP. Clearly, substrate specificity of both the native and recombinant forms of enterokinase for the recognition sequence DDDDK was by no means exclusive. Hydrolysis at the unexpected LKGDR site located towards the carboxyl end on NT-proCNP was significantly more efficient than at the internally sited DDDDK target sequence. However, when this same sequence was sited internally replacing the DDDDK in another construct of thioredoxin/mouse NT-proCNP, it was found to be poorly processed by enterokinase. Our results showed that non-target sequences can be preferentially recognized over the canonical DDDDK sequence when located accessibly at the ends of proteins.
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发表于 2013-11-15 22:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我遇到了相同的问题，用EK酶切有严重的非特异性条带出现。融合蛋白20K，标签17K，目的肽段3K，EK过夜切后有17K和14K两条带出现，20K处的条带完全消失。不明白这是怎么回事。

楼上兄提到EK可以错误切割thrombin位点，可有相关的文献依据？怎样避免类似的错误切割呢？
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