【求助】beta-actin显示多个条带

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标题:【求助】beta-actin显示多个条带

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-11-16 10:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

初次进实验室，做了几次western blotting，用beta-actin做内参。上样之前使用UV750测定总蛋白浓度。奇怪的是每次beta-actin 总是两条甚至三条平行的条带，上样量也不均一。我的具体操作过程如下：
1、目标蛋白分子量70kD，10%分离胶，4%浓缩胶。
2、上样量40ug-50ug。
3、电泳80V至分离胶，100V至loading buffer 刚刚跑出胶。
4、转膜 100V 2h或30V 4度过夜。
5、5%脱脂牛奶封闭2h或4度过夜。
6、一抗目标蛋白：rabbit anti human 1:1000 2h 常温。
beta-actin: mouse anti human 1：10000 2h 常温。
7、TBST 洗三次，每次15min。
8、二抗目标蛋白： goat anti rabbit:1：10000 40min 常温
beta-actin: goat anti mouse:1:10000 40min 常温
9、TBST 洗四次，每次15min。

附件

2013-11-16 10:13

66747892.jpg (17.16 KB)

ROSE李[使用道具]
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发表于 2013-11-16 10:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也刚做蛋白，actin是上面总出现一条齐齐的杂带。有人说与细胞种类有关。如图一
不过我也到过楼上这种情况，推测：是不是样品放在4度时间长了？

ROSE李[使用道具]
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发表于 2013-11-16 10:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有的样actin有双眼皮，有的没有，很奇怪。如果说与细胞种类有关，那么应该是有的都有啊。忘高手解答！

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-11-16 10:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼上分享，但是我们的结果还是有区别的，我的双眼皮条带几乎是对称的，而你的至少有一条是明显的actin条带。我的样品没有在4度放过，从-80度取出来冰上溶解，用完立即放回-80度。再发一张我做的更差的。

附件

2013-11-16 10:15

87420875.jpg (8.19 KB)

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-11-16 10:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

因为我们实验室也有人做出我这样的结果，具体没有人知道
我准备把所有的试剂换一遍，再做一次

hold住[使用道具]
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发表于 2013-11-16 10:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

试剂操作应该没什么问题的，不是说你们实验室也有人做出这样的结果么，做出三条带的人也有阿
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/11309843_1.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/10453409_1.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/8162649_1.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/7333730_1.html')
Dlilychen抗体应该没换过，不同样本的对照也作过了，
细胞内蛋白的翻译加工本身就是件复杂的事情，做过膜受体的WB就明白了，
还有更有趣的
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/9375520_1.html')
样本复杂么？是什么？但肯定不是样本放坏了降解啦，能降解成这么整齐的条带吗？！
你换个其它公司的抗体看看，同一批样本肯定还是三条带
至于条带为什么不起就想不明白了，上样？样本都一样？淬灭？

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-11-16 10:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人找到我的B-actin 多条带的原因：loading buffer 里面的DTT可能变质了。我换了B-羟基丁醇后B-actin 恢复了一条带。

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-11-16 10:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是B-羟基乙醇（mercaptoethanol)

mamamiya[使用道具]
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