【求助】居然不表达，怎么办？

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标题:【求助】居然不表达，怎么办？

龟仙人[使用道具]
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发表于 2013-11-17 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近好不容易做出一个克隆，测序正确，但就是不表达，晕。希望有高手指点一下。

我的载体是pET28a改构得到的，上有一个融合伙伴，在这之后加上我的目的序列。以前的师姐构建的是同样的融合伙伴加上她的序列却表达很好（我作对照表达过，她的融合蛋白比我的小），换成我的序列却不表达了。我的经测序正确，也没有提前终止的密码子，用的宿主菌是BL21(DE3),诱导条件是参照师姐的，培养基是LB。我的这个蛋白也不知道对菌有没有毒性，核酸序列是我在网上设计的（cuturl('http://www.entelechon.com/index.php?id=tools/backtranslation&lang=eng')），考虑了大肠杆菌密码子的偏爱性，也没有选什么稀有密码子。

我诱导了９小时还是没有表达，有人建议再延长诱导时间，这会有用吗？

是不是我得换宿主菌啊？大家推荐几个？

还是我要换载体呢？换得话还要考虑酶切位点的问题？！

做了一年了，身心疲惫，大家帮我想想办法，快疯了。

3648755[使用道具]
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发表于 2013-11-17 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.测序真确，阅读框正确吗？
2，你能保证载体转入宿主菌了吗，你需要提取转化子的重组载体进行验证。
不要急于换载体，先把前面的工作仔细分析一下，一步步来验证，有时欲速则不达，祝好运

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发表于 2013-11-17 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一,WB检测,看看蛋白是否真的没有表达.
二,按照NOV公司的手册,进行重组质粒稳定性测试,看你的质粒是否稳定存在与你的寄主菌中.如果不太稳定,你可以做一个AMP的浓度梯度,看看在哪一个浓度下,你的质粒最稳定.

龟仙人[使用道具]
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发表于 2013-11-17 15:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我正反测序，在T7启动子开始到T7终止子（有一个碱基错误，但是在测序700BP后，所以没有什么参考意义）均正确，起始密码ATG开始翻译，直到我自己加上去的终止子（在T7终止子上游）均正确，至于在这个质粒别的地方有没有错误，我就不知道了。
烦请战友帮忙分析一下，谢谢。
是不是把它重新切下来，再连到同样的载体上会有用？？？
有一个奇怪的现象是，以前做过几个克隆，测序错误，中间少了几个碱基，发生了从中间开始阅读框错误的却能表达(应该终止于T7终止子吧？我不敢肯定，反正我自己设计的终止子TAA废了) ，这是否意味着我的融合蛋白对菌有毒性，使它不表达啊？？

xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-11-17 15:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也是有两个序列用pET28a Ecoli BL21DE3不能表达,测序完全正确!阅读框正确,真是邪门了,现在构建到pMAL-P2X里面进行融合表达,过一个礼拜就知道结果了,到时候再告诉你

966735obeng[使用道具]
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发表于 2013-11-17 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

也不排除表达蛋白有毒性，但一般情况下是以包涵体存在的，应该不是。
这样吧，两个试管培养5ml，Amp加至终浓度200，过夜，一管抽提载体验证，一管离心，去上清，将菌体接入100ml新的抗性培养基，4－6hr,加IPTG至0。1，诱导8个小时。

nikun230[使用道具]
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发表于 2013-11-17 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PET28a是kana抗性,应该不会象氨苄那样子,楼上老兄的建议很好,提个籽粒

moonlight45[使用道具]
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发表于 2013-11-17 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的质粒不表达，原因很多。
从你的叙述中，我还有几个问题想询问，以便分析原因：

(1)你所说的不表达，是你在重复做表达实验多数次后产生的怀疑？一次，两次，N次？如果是一次或两次，有时候不一定的。如果是多次，得出了不表达的怀疑，可以尝试更换表达细菌，比如DH5-α等。

(2)你如果做了多次表达实验，那么每次都是用你的质粒转化细菌、然后挑选克隆，再进行诱导表达吗(一条龙做下来)？因为当中涉及到质粒稳定性问题。如果你没有按这种方法连续做，而是多次表达实验都沿用了第一次的已经转化好的克隆，那么这些克隆有可能已经丢失了质粒。建议重新配制相关试剂，从转化、挑选克隆、诱导表达、SDS-PAGE连续做一次，没准就出结果了。

祝你早日成功！

owanaka[使用道具]
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发表于 2013-11-17 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

原核系统表达我做了快两年了,你遇到这个问题我也碰到不少,我觉得这个问题比较复杂,你可以按照以下思路做一下.
1.是否真的不表达?你SDS-PAGE跑不出来特异明显的诱导后的条带,并不代表就一定没有蛋白表达,是否做过western-blot?我原来做个一个单链抗体,SDS-PAGE 就是看不出来有明显表达,但是western-blot非常明显!所以,我建议你做过western-blot,如果有表达而且你需要蛋白量不是很大的话,OK,往下做吧.
2.如果western-blot都不可以做出来的话,你就要考虑很多问题了.首先,我觉得你的表达蛋白是否有毒性,如果有的话就改用BL21(DE3)plyss(Novagen),这种细菌可以抑制本底表达,从而提高毒性蛋白的表达量.
3.如果还不行的话,换有相同酶切位点的pET载体!这样也许可以大量提高表达量,我觉得蛋白不表达的话需要更换系统,动大刀子,而单纯调整抗生素浓度,换新鲜LB这样一些小动作不一定有很大的作用.纯属个人意见.
4.以上是我一些切身体会,希望对你有作用,还有,仔细阅读体会Novagen的pET表达系统这本书,我觉得是很有作用的.

zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-11-17 15:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在也用pET30Angel载体构建了两个重组子, Bl121(DE3)plsS中试图表达感觉没有成功,分子量是5K,10K.诱导4hr电泳不见条带,也很郁闷.我的酶切位点是第一个NdeI & HindIII. 楼上的几位高手认为可能是质粒丢失,但我觉得在抗生素存在条件下菌株能够生长质粒应该存在. 另外请教高手:
5K的小片断,是否表达较少?应怎样提高跑胶的检出效果?
我的菌株在诱导后颜色由淡黄色变为黑色,是否说明已经有所表达?

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