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标题:【求助】单克隆抗体的亲和柱纯化

minran_1980[使用道具]
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发表于 2013-11-17 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】单克隆抗体的亲和柱纯化

各位同仁:
近期要做单抗纯化,希望免疫小鼠后从血液或腹水中纯化得到单抗,单不知抗原与sepharose /sephadex 结合如何操作,以及选柱问题,希望各位赐教,如果大家有相关资料更好拉!!!
谢谢!!!
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2013-11-17 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白纯化方法有很多种，五大方法：凝胶过滤、亲和层析、离子交换、疏水层析、反向层析，不同的纯化方法各有不同的层析填料，应该根据特定蛋白的性质，如酸碱性、电荷、分子量、生物特性以及你的目的选择相应的层析材料，还要权衡一下你的的实验经费与实验条件。
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nn255[使用道具]
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发表于 2013-11-17 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
CNBr-actived separose fast flow 的说明书上有，按照说明书的操作即可
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发表于 2013-11-17 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

买一根ProteinA的柱子不就得了，又不贵，安马西亚，AGTC，bi'o－red都有卖。
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发表于 2013-11-17 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做之前要看的材料还很多。免疫亲和层析不比其它亲和层析，因为配基是抗体，配基的亲和力和柱上的密度至关重要。

配基太密，特异性不好。配基抗体与抗原的结合太强，最后不易洗下抗原。所以对于免疫亲和层析的柱参数，是很复杂的工作。而且用单抗做配基，还是比较贵的，费钱费时！建议选择此种方法要慎重！

我当时用辛酸-硫酸胺法沉淀，这样省时，纯度可达90%，用来偶联溴化的Sephorose 4B 足够了。至于如何操作，说明书上有详细说明。
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minran_1980[使用道具]
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发表于 2013-11-17 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
腹水
谢谢各位,不过可能是我说的不清楚,实验设计是用抗原多肽免疫小鼠后,取血液或腹水,然后将血液或腹水样品上亲和层析柱,利用结合在凝胶上的抗原多肽与样品中的抗体特异性结合,纯化得到单克隆抗体.不知道有没有响应的资料
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发表于 2013-11-17 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.买一些活化好的sepharose自己偶连，
2.买一根ProteinA柱子，纯化单克隆抗体效果非常好
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c86v[使用道具]
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发表于 2013-11-17 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

先可以用饱和硫酸铵法进行粗纯，因为亲和层析也不可能一步达到很高的纯度；第二步可选用Protein A亲和层析或阴离子交换层析Q Sepharose HighPerformance进行
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发表于 2013-11-17 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位,不过可能是我说的不清楚,实验设计是用抗原多肽免疫小鼠后,取血液或腹水,然后将血液或腹水样品上亲和层析柱,利用结合在凝胶上的抗原多肽与样品中的抗体特异性结合,纯化得到单克隆抗体.不知道有没有响应的资料.

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给你查了一些文献，你看看哦，这是属于免疫亲和层析方面的知识，大同小异，基本上都适用的，不管是单克隆抗体还是多克隆抗体
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douding66[使用道具]
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发表于 2013-11-17 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位,不过可能是我说的不清楚,实验设计是用抗原多肽免疫小鼠后,取血液或腹水,然后将血液或腹水样品上亲和层析柱,利用结合在凝胶上的抗原多肽与样品中的抗体特异性结合,纯化得到单克隆抗体.不知道有没有响应的资料.

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这样做无法得到单克隆抗体。

单克隆抗体是针对单一抗原决定簇的。现在得到单抗的方法是做鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，或是直接从基因表达制备。
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