小中大【讨论帖】Western Blot 傻事儿集合-教训讨论贴
成功经验听多了，偶尔也要谈谈失败的经验，大家引以为戒。师弟师妹们试验出了问题，凡是我犯过错的都能很快指正。
大家做过什么失败的实验，都来分享一下吧~最好附上解决的办法，错了没事，改了就好。
你有啥不开心的啊，说出来大家高兴高兴~~
1、SDS-PAGE不拆胶条
电压调到120V,电流就是上不去，跑了三四个小时之后，师姐过来一看，你胶条都没拆呢！还跑那么久！
2、内外板放反。
低的一面冲外。不知道大家用的电泳槽是不是一样，里面低一些的是正极，外面是负极。这次好一点，跑了十来分钟就发现了
3、用错二抗
明明是兔的一抗，我迷迷糊糊用成了鼠的二抗，发现以后赶紧拿出来洗了两遍重新孵兔二抗，结果最后没出。
所以，用二抗前一定要认真核对啊！用错了基本可以报销啦
4、配10% SDS,总是不溶，放到搅拌器上搅了半天，全是泡沫~ 我又急着用，容量瓶定容的时候泡沫遮住了定容线，我一下子就把水加过线了，555，白配了
后来发现，SDS一加热还是很好溶的。不用使劲搅也能溶了。
PS:当时刚进实验室，配什么都不敢马虎。搁现在，肯定拿来接着用拉。
5、电泳缓冲液反复用
刚开始做实验比较偷懒，缓冲液用完了就拿旧的一直用。结果证明，用旧缓冲液跑SDS-PAGE会使带型变差，而且造成样品污染，重复两三次还好，但是千万别次数太多。
电泳缓冲液应该这样用：外槽的用完倒掉，内槽的留着下次做外槽缓冲液。这样比每次全换省一半，还不会造成样品污染。
还有转移缓冲液，用次数多了甲醇浓度会变低，转移效果明显不如新配的。
6、做SDS-PAGE胶需要配含4% SDS的Tris溶液，一般都是最后一步加10%SDS溶液。我有一次配了1L，10%SDS溶液不够了，就直接称了SDS粉末加进去，结果一直溶不干净，加热溶了，放到室温就又会出现大量白色絮状物飘在溶液上层。可怜我配了1L啊~
后来还是用10%SDS溶液来配才清澈的，不知道别人有发生这种情况么？但是配坏的那瓶加热溶了一样能用的，就是麻烦点儿。好在夏天到了，天一热我分装在小瓶里的就清澈了，趁夏天赶紧用，1L呢~
7、曝光时膜贴反
正面朝下了。结果也有条带，但是颜色比较浅，边际模糊，条带比较粗。因为相当是正面发的光透过PVDF膜再曝，有两条紧挨着带都分不开了。所以，在膜的右下角做标记还是非常必要的。
8、质粒降解。这是最惨痛的一次教训。纯水溶的质粒，每次做细胞转染都要冻融一次，慢慢就降解了。但是有师姐之前成功的先例，我就直接拿来用了。做了无数次转染，无数次Western blot,连抗体都换了新的，就是测不到外源表达。555~ 居然是因为质粒降解没了。所以，Western 不出结果可能的原因很多，不一定是western中出的问题！
看我犯过的这么多低级错误，您还有啥不好意思地，糗事儿都说出来轻松一下嘛。嘻嘻
谢谢回帖交流的战友们，发现大家犯的错很多都挺一致的，嘻嘻
