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标题:【讨论帖】WESTERN疑难问题汇总

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发表于 2013-11-17 20:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】WESTERN疑难问题汇总


WESTERN的过程中总是出现很多难以解决的疑难，影响了实验进程。希望大家提出一些实际的疑难，然后再进行解答，大家写出自己的经验，可以大家比较经验，互相学习：
1. 盖保鲜膜时，许多时候导致荧光淬灭，怎么解决
2.如何尽量提高蛋白浓度，具体裂解液 ，步骤
3 转膜后，丽春红染色，为什么泳道上染出的蛋白都是竖条纹的，是提蛋白不好还是其它原因吗 对结果会有什么样的影响
4 暗室中曝光，是肉眼看到荧光好还是看不到好 ，看不到条带曝多长时间比较好
5 为什么ACTIN条带很好看，而大分子的目的条带总是没有成形的好条带，有可能是蛋白被破坏了吗？或是蛋白提得不好吗？
6 如何正确的浇ECL 具体浇多少量，多长时间，可以曝后再反复浇吗
7 为什么有时候背景非常高，怎么调也调不掉，
8 如何高效率的摸抗体条件

谢谢大家的支持，为了使大家实验能够高效快速，能不能大家写得 具体一点，具体的 数据， 步骤， 配方 和 举例 等等 我改天也会补充的
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发表于 2013-11-17 20:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于1，我们是这样解决的，我们不盖保鲜膜，直接曝光，但为了不让胶片和膜直接接触，我们自做了一个装置，是中空的，中间正好可以放入膜，上面有一个透明的硬塑料膜，但由于是中空装置，所以不会直接接触膜，曝光时，胶片盖在硬塑料膜上，减少了很多不必要的淬灭，条带恒定持久，而且结果也比较准确。
不知道大家是怎么解决的
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发表于 2013-11-17 20:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于4，我认为在暗室中能够看到荧光比较好，但有时候看不到荧光我就放弃了，但听其他战友说，看不到荧光也可以曝，而且条带也比较好看，但我们从来没有在没有荧光下，曝出来条带。看不到荧光时，该怎么曝呢
大家认为呢
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发表于 2013-11-17 20:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于7，
有好几种情况：
1. 一抗浓度比较高
2. 二抗浓度比较高
3. 洗膜时间不够，或TWEEN-20的量比较少
4. 还有可能是，胶的问题，有一次我们ACR 配得不好，怎么做都有背景，后来重配了ACR就好了

有没有可能是提蛋白的问题呢？ 提蛋白时应该注意些什么问题呢？
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发表于 2013-11-17 20:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于4,个人觉得当然是看到有荧光条带更好，最少让人觉得更有底气,但是有时候没有看到也并非一定没有结果.
因为:即使除了主观的原因外,没看到荧光也并不说明一定就没有抗体结合上去.我的个人实践为我证明了这一点.至于如何调整曝光时间,个人观点:先给予2-3min的曝光,再根据洗出来的胶片情况进行调整;如果背景及条带深,则减少曝光时间,反之则相应增加曝光时间,不过一般是要经过比较长的曝光时间进行曝光的,我曾经有一次曝了好几次都没有东西,最后死马当活马医治,曝了差不多30min,后来洗出来的胶片,看到了条带.
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-11-17 20:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问我用的是10%的分离胶，4%的浓缩胶，跑marker时候老是只能跑出六条带，而marker下面的34KD和26KD跑不出来，而我的蛋白分子量是34.27KD,请问这是为什么？我用的marker是fementes的可以跑10条带的
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发表于 2013-11-17 20:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

问题７也是困惑了我好久的问题，我的蛋白２１ＫＤ，转膜用０．２２孔径的ＰＶＤＦ膜，在暗室里可见整张膜都特别亮，结果暴出来的片子很快就黑了，目的蛋白的条带就显得很弱，我曾经试过的改进办法：
１．原来用５％脱脂奶粉封闭改为３％ＢＳＡ封闭；
２．封闭条件由３７度封闭一小时改为４度过夜；
３．一抗，二抗洗膜条件为ＴＢＳＴ洗３次，每次１５分钟；
４．缩短暴光时间，显影时间
高手帮忙分析还有什么原因
楼上战友还提到ACR 配得不好会有影响，请问是什么样的影响？谢谢
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发表于 2013-11-17 20:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

4 暗室中曝光，是肉眼看到荧光好还是看不到好

这是一个伪命题，没做过western的人也应该知道是看到荧光好，建议楼主把问题改为“暗室中曝光，肉眼看不到荧光怎么办”。

我个人的经验是，看到荧光的，比如内参、HSP、BiP等高表达蛋白，一般曝光15-30 s，条带非常清晰漂亮。
如果看不到荧光，可以从几个方面解决：
1.ECL接触时间延长到2min
2.适当提高蛋白丄样量
3.适当提高一抗二抗浓度
4.提高曝光时间。

没有荧光，提高曝光时间，很多时候能得到条带。但如果时间过长，膜背景会比较脏。如果延长时间没有用，可以考虑1，2，3
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-11-17 21:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

6 如何正确的浇ECL

加ECL的关键是让整条膜能均匀接触到ECL，尤其是要注意膜的两侧也要完全接触ECL。此外，个人经验是最好AB液混合好以后再放入膜，千万不要单独接触膜，尤其是B液
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ritou1985[使用道具]
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 小中大

2.如何尽量提高蛋白浓度
这个相对简单：如果你对提取的蛋白无特殊要求，用超声破碎细胞得到的蛋白丰度很高。
如果用裂解液，也可以裂解配合冻融，蛋白量也可以搞点。
还有，裂解液要放合适，不要太多（当然也不能太少）。

蛋白浓度不是高就好，只要够用就行。
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