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标题:【求助】原核表达做了两个月,没结果

羊咩咩[使用道具]
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【求助】原核表达做了两个月,没结果

小生作一新分子的原核表达,预测分子量9.0 KDa左右,载体是pGEX-2T,GST融合载体,测序也正确,试过37度,30度,28度,IPTG 0.4-1.0mM,都不表达,连包涵体都没有。真急人啊。各位提提建议,不甚感激!
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小螺号[使用道具]
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1 温度可提高至40度或42度;
2 诱导的时间最好从1小时到8个小时,每小时取样一次,跑SDS-PAGE;
3 看一下你用的载体是否正确;
4 IPTG的浓度可试一试0.1-0.4和1.0-1.5mM;
5 实在做不出来,可考虑换表达载体;可用pET载体和一些新的GST融合表 达载体。
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白白的[使用道具]
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同意楼上做法!
温度可降低,我做的是20度,表达出来了,而且大部分是可溶的!
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2541[使用道具]
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考虑有无信号肽序列或核定位序列,有无稀有密码子影响
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sistis[使用道具]
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5
 

除了诱导条件,第一,先看看是不是稀有密码子的问题,在分子生物学书上可以看到大肠杆菌缺乏的密码子。第二,到网上预测一下你的蛋白,是不是膜蛋白,它的二级结构,定位在什么地方。网站cuturl('http://ca.expasy.org')
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biabiade[使用道具]
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同意二楼的建议,
不过还有一种可能性就是你的蛋白已经表达出来了,可能浓度太低,跑电泳不一定能跑出来,这样你就可以借助一些提高电泳灵敏度的技巧来试试了。
如:1、进染色方法,银染,最近看到一篇关于考染的改进方法,不错
传统的胶体考染法(Electrophoresis 1988,9,255-262)
染色液的成份(0.1% G-250, 10%(NH4)2SO4,2% H3PO4,20%甲醇)

[1] 固定:12%(W/V)三氯醋酸(TCA)2h
[2] 染色:200ML染色液混合50ML甲醇 16-24h(染色液:在490ML含2%的H3PO4中加入50g(NH4)2SO4直至完全溶解,再加0.5gCBBG250搅拌混合,定容至500ML使用前摇匀)
[3] 漂洗0.1mol/L Tris-H3PO4(PH6.5)漂洗两分钟;25%甲醇漂洗不超过1分钟
[4] 稳定:在20%的(NH4)2SO4中稳定蛋白质-染料复合物。
优点:背景低,灵敏度高,可达30ng protein/spot

改进的胶体考染法—Blue silver法(Electrophoresis 2004,25,1327-1333)

染色液的成份(0.12% G-250, 10%(NH4)2SO4,10% H3PO4,20%甲醇)
100ml H2O+100ml H3PO4+100g 粉末状(NH4)2SO4 先溶解,然后加入 1.2g G-250 再溶解,用水定容到800ml ,搅拌后加入200ml甲醇。
灵敏度可达1ng protein/spot

染色方法同上。
2、蛋白先浓缩再跑电泳,可以采用TCA沉淀法
If your protein is too dilute, you need to concentrate it before load on gel. Here is a method to concentrate protein before gel:
CHCl3 Precipitation of Proteins
For concentration of proteins from a variety of aqueous solutions.
In a 1.5-ml eppendorf tube take
0.1 ml of sample (or as much as possible)
add
0.4 ml of MeOH
0.1 ml of CHCl3
0.3 ml of H2O (optional)
This should give two phases upon centrifugation at 12,000g for 1 min. Protein should be precipitated at the interface. Pull off the upper phase leaving precipitated protein behind.
Add 0.3 ml of MeOH to give one phase.
Centrifuge at 12,000g for 2 min. Precipitated protein should pellet to bottom of tube.
Note: it is possible to scale up by 1.5x and still fit in a microfuge tube.
祝你成功!
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羊咩咩[使用道具]
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很感谢各位提出的建议,我看了一下,这个分子氨基酸序列中稀有密码子有16个,达到20%,要想用碱基突变的方法来更换为大肠杆菌偏好碱基是很难做成的。另外,预测它有两个跨膜区,N端可能在膜内,至于它与原核表达的关系,我还不懂,请swing2004解释一下。预测无信号肽。40度能诱导出蛋白吗?因为一般是低温诱导啊。pET载体是不带GST标签的吧?
感激!!!
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只有约80aa,应该是能够融合表达的。
包涵体一般出现于表达比较多的时候。也可能是表达了,但和菌体蛋白大小相仿,不容易见到。改变PAGE胶的浓度,使它出现在胶的中间位置,以和周围的条带可以清楚分离。
也可以换载体或宿主菌试一下,或者用western检测。
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owanaka[使用道具]
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我用PQE-30载体,也遇到了表达不出来的情况,实验计划已经超期两个月,读5年学位是肯定的了
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viviwang1987[使用道具]
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很感谢各位提出的建议,我看了一下,这个分子氨基酸序列中稀有密码子有16个,达到20%,要想用碱基突变的方法来更换为大肠杆菌偏好碱基是很难做成的。另外,预测它有两个跨膜区,N端可能在膜内,至于它与原核表达的关系,我还不懂,请swing2004解释一下。预测无信号肽。40度能诱导出蛋白吗?因为一般是低温诱导啊。pET载体是不带GST标签的吧?
感激!!!

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看看在起始的前25个密码子或40个密码子内有多少个稀有密码子?有无稀有密码子串联?如果有多个或串联,可用融合PCR 改造,试一试。
同时准备构建其他载体,两头走
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