液相色谱

近做一个分子量在70KD左右的糖蛋白，
用色谱柱的型号是TSK G2000 SWXL,7.8*300mm)
流动相： 40mmol/L磷酸盐缓冲液，300mmol/LnaCl PH:6.8用0.22um过滤膜过滤
色谱条件： 流速0.5ml/min,上样量20微升
柱温： 20-25度
紫外检测波长： 280nm
系统压力： 29~31bar
步骤是：
1.分别用甲醇、超纯水冲洗系统至基线平衡，（柱子用甲醇保存）
2.换配置好的流动相以0.5ml/min平衡色谱柱到基线平衡。
3.取样品20微升上样品，(经过0.22um滤膜过滤，)记录时间40min，
4.这个柱子用了一年多，一直没有用预柱。

结果色谱峰拖尾严重，一直都是这样，对称因子达不到药典的要求，塔板数也不够。
这个柱子用甲醇保存过，也用叠氮钠保存过，现在怀疑是不是柱子塌陷？
我们用另外一个样品（人血白蛋白）做对照时就不存在拖尾现象，但是测试这个样品就拖尾严重，请高手指点，
或者有哪位战友也用过这个柱子的传授一下是怎么保养柱子的，实验方法怎样？另外这个柱子能否反冲？
这是所测样品的色谱图（拖尾严重）；

另外一个是采用同样方法测得人血白蛋白样品，基本无拖尾。

样品和对照品的溶剂都一样吗，都是用流动相溶解的？是不是样品溶液对PH的影响比较大或样品中存在与主成分保留时间相似的物质。

样品和对照品的溶剂都一样的，和流动相成分一样,

是不是样品溶液对PH的影响不大，样品等电点在4.5-5.5左右，

样品中存在与主成分保留时间相似的物质，这个有可能，我的样品是有两个亚基经二硫键连接而成的，可能存在比我样品分子量稍高的二聚体，但是二聚体出峰时间应该在前面的，不应该拖尾啊？

请假用过这种柱子的朋友，是怎样冲洗和保存再生的？用的什么试验方法？

我想请教，根据这个实验结果，能看出我的柱子是不是存在问题呢?需要对柱子反冲处理一下吗？

第一个图形的样子，我怀疑是ph值或盐浓度的问题，建议从新配一下流动相试下，再就是是不是进多针后也是这种情况呢？还要考虑一下你的柱子是否开始没有平衡！

不同的填料，有不同的出来方式，有时候还要看平时流动相的比例！

很有可能是样品的PH值没有调节正确，对照品出峰正常说明柱子没问题！！

对照品存放时间 是否过长？流动相重新配置再进样查看下

换几个ＰＨ看看，当然不要超出色谱柱的使用范围，色谱柱的维护说明书中肯定有说明，如果没有还是咨询厂家色谱柱工程师为好。

如果两个图，出来样品不一样，其他都没变，那就不是柱子的问题；

把盐浓度调大点，或者把PH加大点试试，注意要在柱子的耐受范围之内

TSK sw系列的柱子适合蛋白质的分离，你的样品为糖蛋白，既有蛋白又有糖的性质，所以分离不好，蛋白肯定没问题。这其实与用PW分离蛋白是一样的，都会有拖尾。所以你只能改变流动相试一试。