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标题:【求助】如何进行蛋白浓缩又不破坏空间结构?

popo520[使用道具]
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【求助】如何进行蛋白浓缩又不破坏空间结构?


请问各位大侠,我做Far WB,由于要保持蛋白空间结构,所以不能用TCA沉淀蛋白,但如果直接用透析后的蛋白上样,浓度又太低,跑SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色根本就看不见条带了,不知有什么好方法能把蛋白溶液浓缩一些呢? 听说超滤膜可以,不知如何选择超滤膜呢?
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any333[使用道具]
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试试用PEG直接对透析带进行浓缩
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dog002[使用道具]
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蛋白浓缩方法基本有:
丙酮沉淀法;免疫沉淀法;三氯醋酸沉淀法;硫酸铵沉淀法;(低温)有机溶剂沉淀法;聚乙二醇沉淀法;超滤法;透析法;离子交换层析和冷冻干燥法……
1,丙酮沉淀法;三氯醋酸沉淀法试验要求的仪器简单,但是常常导致蛋白质变性。
2,免疫沉淀法:得有特异性抗体
3,硫酸铵沉淀法:利用高浓度盐将蛋白质析出(盐析)
选择硫酸按是因为:盐析有效性,pH范围广,溶解度高,溶液散热少,经济,大多数的蛋白都可以用资格方法
4,(低温)有机溶剂沉淀法:强调低温(0-4度以下)是因为10度时蛋白会在有机溶剂中变性,可用乙醇,丙酮……注意:Mg2+离子,pH值
5,聚乙二醇沉淀法:使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性!他溶解是散热低,形成沉淀的平衡时间短,通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀!
6,超滤法:主要针对小体积蛋白质溶液(几ml)此法不易引起变性,不过得有浓缩器,不是哪个实验室都有的
7,透析法:主要用于更换蛋白质的缓冲液,得有透析袋。不需要特殊的仪器 。一般用得是PEG20000进行实验,简单,快速,对蛋白没什么影响
8,离子交换层析:可用阴离子交换树脂进行浓缩
9,冷冻干燥法:在冷冻状态下让样品中的液体升华 ,需要冷冻干燥机,该方法对蛋白活性保存最好。纯物理方法
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bring[使用道具]
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有条件的话,可以用浓缩管离心浓缩,比较快捷方便,millpore就有各种型号的浓缩管。补充一句,要低温离心
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popo520[使用道具]
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多谢各位朋友指教。 请问PGE透析时怎么配这个透析液呢? 好像蔗糖也可以用来透析。 另外PGE20000 其中的20000是不是截留分子量的意思呢? 也就是说PGE20000可以保留住 60KD以上的蛋白咯? 我的目的蛋白是50KD左右啊
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popo520[使用道具]
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我试过超滤器,但是有个问题就是用超滤膜的话蛋白可能会附着在膜上,这样要损失一些蛋白啊
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any333[使用道具]
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PEG20000的20000不是指截留分子量,它是指PEG的平均分子量,截留分子量只与你所用的透析袋有关。
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popo520[使用道具]
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请问PEG的透析液怎么配呢? 是直接把PEG加入蒸馏水配成30%-40%浓度么? 还需不需要加别的东西和调PH呢?
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tangxin_80[使用道具]
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PEG20000,直接将透析袋放入PEG干粉中,量要少,PEG的吸水能力还是比较强的
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popo520[使用道具]
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还有一个问题想请教一下,不同分子量的PEG有什么区别呢? 例如PEG8000与PEG20000,我该如何根据蛋白大小来选择不同分子量的PEG呢?
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