小中大21.另一个很重要，并需要确定的是成像系统，以及可以选用的蛋白质印迹试验的试剂盒。选择了荧光系统就可以进行蛋白质定量分析及计算。现在可以选择的荧光成像系统，比如说，Typhoo Imager，或者说Ettan DIGE imager,以及 Storm imager。
22.为了更准确的去选择正确的成像系统，我们就必须首先知道该系统有相对应的荧光分子有相应的激发和发射光谱。
通常在市场上购买的荧光试剂都会说明该荧光分子的激发和发射光谱，成像系统上的光源要接近荧光分子的激发波长，同时成像系统上要配有相应的发射滤光片，可以过滤出荧光的发射光谱；还需要足够宽的动态范围来支持信号自身的动态范围，而且成像系统的动态范围要高于信号自身的动态范围。
其他的还要注意其灵敏度，要高灵敏度；低噪音背景；良好的分辨率；这些都能够帮助检测到不同表达量的目的蛋白。
23.在下面这副图里面可以看到，针对多重荧光蛋白质印迹试验所选用的发射激发光谱。我们可以看到Cy2、Cy3、Cy5的发射激发波长分别为488 nm,532 nm,633 nm。其发射光谱范围分布在520 Bp 40，580 Bp 30，670 Bp 30 之间。要注意的是它选择的滤光片都是Bp的滤光片，***滤光片，***滤光片能有效的过滤目的信号，减少干扰信号的存在。
24.选择成像系统的另一个重要的指标是动态范围。足够宽的动态范围才能够保证在一副图像上同时检测到高丰度蛋白和低丰度蛋白，而传统的胶片由于其有限的检测范围，很容易对高丰度蛋白产生过饱和的信号。
25.高灵敏度也是一个非常重要的指标。在这里指的是可以检测到极低丰度的蛋白质，或者是图像上扣除了背景的信号强度，或者是检测的极限。
对于可以真实的定量的另一个重要因素就是取得漂亮的线性信号结果。这些都是对高灵敏度的一个详细的描述。
26.分析荧光蛋白质印迹或者是普通蛋白质印迹试验所需要的分析软件。在任何批次运行的试验下，软件都必须给出定量的，可靠的定量结果。
在下面的例子里可以看出使用IQTL软件分析多重蛋白质印迹试验的结果。该软件可以回答很多有意义的问题，它能区分去来自Cy3和Cy5的信号量。所有这些可靠的信号都可以进行精确的比较。所有的试验分析数据结果都可以输出到Excel文档中。
27.在图中的的这个表格中，我们可以看到，它包含了每个通道蛋白原始的Value值，以及相对看家蛋白进行归一化处理之后的校正Value值。体现出了更精确的定量结果。
28.最后来介绍一下做荧光多重蛋白质印迹实验的操作要点和小技巧。
29.在进行蛋白质印迹实验时，往往会遇到一些难题，其中最重要的就是往往花了很多的时间来优化抗体的浓度。一开始有些研究人员加了太多的一抗和二抗，这就会导致非特异性结合，这种非特异性结合就会产生大量的荧光信号，就要严重干扰目的样品的真实信号，所以取得合适的一抗和二抗浓度稀释比例才能有效的减少非特异性结合，才能有效的节约后期的操作时间。
30.接下来要注意的是，多重荧光蛋白质印迹实验中应避免的一些操作。在操作荧光时要注意，有些物质在杂交前不能使用，比如考马斯亮蓝；有时工作人员会将膜放在有考马斯亮蓝残余的染色盘中，或者是残有溴酚蓝前沿，这些都会导致在成像时产生假阳性信号，会掩盖掉样品真是的信号定量。同样还要注意的是聚丙烯酰胺胶的碎片残留，也要完全被去除掉。
有些研究人员在操作膜的时候，要对膜进行标记，要避免使用圆珠笔，因为圆珠笔的黑色印渍会留在膜上，成像产生伪信号，也会影响到信号的定量。
其他要注意的是，有些化学物质要避免使用，比如说triton x-100。手套上的粉末或者脏的镊子也会在膜上留下干扰信号，这都是要避免的一些实验操作。
31.下面我们来看一下具体的操作图片。
这一幅图片，我们可以看到要避免考马斯亮蓝的操作，因为我们都知道，实验室经常有一些染色盘会进行考染或硝酸银染色，这些染色盘上由于没有完全清洁干净，会残留有考马斯亮蓝，这些残余的试剂很有可能粘附在膜上，在荧光成像的时候就会产生一些伪信号，错误的假阳性信号。
32.在下面这两幅图里面，我们可以看到的操作是：去除胶上面的上样孔和溴酚蓝前沿，这些操作都有助于我们看到真是的目的信号。
33.下面这些操作是要避免一些对膜的污染和错误性的操作。因为往往成像系统是非常灵敏的。它会记录下来任何在膜上的污染物质的信号，所以在操作时要尽量避免污染。在操作膜时，一定要使用平头、光滑的镊子，不要使用尖头的镊子，因为尖的镊子会在膜上留下印子，影响到真实蛋白的表达定量，另外要注意的是不要用手直接去接触膜，因为手上的油脂会留在膜上。避免用圆珠笔标记膜，改用对膜切角或用铅笔标记。
34.我们还要注意的是，在荧光蛋白质印迹试验中，最好使用低荧光背景的膜，因为有更低的背景值，就能得到更高的信噪比。所以更重要的是要看到更低表达丰度的蛋白质，所以在任何时候，做蛋白质荧光印迹实验，都要使用低荧光膜，我们在这里推荐Hybood LPF(低荧光PVDF)膜。
35.在扫描成像时，可以对湿膜进行扫描，也可以对干膜进行扫描。但是为了获得更低的背景，推荐使用干膜成像。在干燥膜时要注意使膜完全的干燥，如果膜的一部分仍然是湿的，就会产生不同的背景强度，只有完全干燥的膜才能获得最佳的信噪比结果。还要注意要将膜上有蛋白的那一面放在扫描平台上进行成像。
36.最后要注意的是扫描成像。无论将膜放在成像盒或扫描平台上成像时，都要保证使成像盒和扫描平台完全清洁干净。所以每次在扫描前，都要用70%的酒精清洗成像区域，才能将一些可能的污染物质清洗掉，不会导致信号的损失。还值得一提的是扫描是要在膜上压上一张低荧光板或重压物，防止干膜在扫描成像时移动导致信号错位。
37.以上都是操作要点和一些小技巧的介绍，希望对大家的实验有所帮助。现在我们有专门的eclnetwork网站。这是一个非常好的网上资源，有许多的protocol、技巧和各种信息，也有论坛提供大家讨论问题，希望大家踊跃参加这个网站，参与讨论。
谢谢大家参与本次讲座！
