小中大【求助】同样条件，为什么我的蛋白没转到膜上呢？
我做了两次wesern blot，没有结果，而且现在我也不知道问题在哪，所以没法继续做，请大家指教！
我检测的两个蛋白分别是Slit2和robo1（125 kDa），买的一抗是santa cruz的，二抗是实验室公用的，应该没问题。
第一个问题：
slit2的一抗说明书APPLICATIONS部分写着
“Molecular Weight of full length Slit2: 200 kDa.
Molecular Weight of Slit2 N-terminal cleavage fragment: 140 kDa.
Molecular Weight of Slit2 C-terminal cleavage fragments: 55-60 kDa.”
这是不是代表我的抗体能够识别slit2的全片段、N和C末端呢？
下面简述实验过程：
上样总蛋白每孔60ug左右
浓缩胶5%，恒压100V，50min
分离胶8%，恒压150V,40min
第一次转膜条件如下：
actin转膜350mA，70min
目的蛋白转膜350mA，150min(切胶的时候是从120到250切在一块)
结果：actin 条带清晰，余未见任何条带
然后用考马斯亮蓝染转过膜的胶显示：actin 42 kDa处以上和以下都可以见条带，尤其是在55 kDa处见明显的条带
目的蛋白那块胶上见几条细细的条带
用丽春红染膜，只见actin的位置处有条带
考虑转膜时间不够
第二次转膜改变条件如下
actin转膜350mA，100min
目的蛋白转膜350mA，210min(切胶的时候是从120到250切在一块)
结果：跟上次的结果一样，actin 条带清晰，余未见任何条带
然后用考马斯亮蓝染转过膜的胶显示：actin 42 kDa处以上和以下都可以见条带，在55 kDa处仍能见明显的条带
目的蛋白那块胶上见几条细细的条带
用丽春红染膜，只见actin的位置处有条带
但是同实验室的同学50-60 kDa，转膜都只用90min，结果很好，为什么我们用的同样的机子（北京六一电泳仪），同样的电泳液和转膜液，我用了100min，55kDa处的蛋白都转不上去呢？而且第二次延长转膜时间后，结果跟第一次没有任何变化？只是单纯的转膜时间不够吗？我的转膜时间好像也不短了。还是有其他的问题？
请大家帮帮忙，谢谢了
