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标题:【求助】Western失败 求助高手解决

flower@@[使用道具]
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发表于 2013-11-23 22:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Western失败 求助高手解决


大家好！目前我检测大鼠血液淋巴细胞中的HSP70蛋白，已经做了n次，均以失败告终。我的心经历了无数次的摧残，恳请大家帮忙想想办法！

我实验的程序是这样的！

1.大鼠腹腔动脉采血，提取血液中的淋巴细胞后，80摄氏度保存。

2.采用普利莱公司的总蛋白提取试剂盒提取淋巴细胞的总蛋白。

3.电泳

4.转膜（慢转，40mA，12h）

5.封闭2h

6.PBST洗三次，每次十分钟

7.一抗孵育（abcam公司的抗体，货号为ab47455）

8.PBST洗三次，每次十分钟

9.二抗孵育（santa公司的二抗）

10.PBST洗三次，每次十分钟

11.显色AB，ECL，红外均检测过

结果：内参出，目的蛋白就是不出，死也不出，大家帮我想想办法啊！！！
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vcve[使用道具]
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发表于 2013-11-23 22:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
抗体稀释度，上样量都玩过了吗？封闭用的啥？
尽量多给些细节吧
不过内参出，目的蛋白不出，看来有点悬了
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2013-11-23 22:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先检测一下抗体吧，再检查一下蛋白提取的过程可能会发现问题。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-11-23 22:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.蛋白量是否够？可用1.5mm板跑。上样量可达50ul。 也可浓缩后再做。

2.分子量大小：太小可能跑出胶，太大可能没在你的检测范围。

3.转膜是否转过？或者没转充分？

4.抗体效价太低？抗体过期？抗体就是个坏的？

5.本身表达太低。

6.蛋白酶抑制剂是否有加？

7.曝光时间可以延长到相当长，如过夜，如果还没有，真没有。
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birdfish[使用道具]
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发表于 2013-11-23 22:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

主要看一下抗体的问题，一般只要抗体没多大问题的话，一般WB还是很能耐折腾的，呵呵
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flower@@[使用道具]
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发表于 2013-11-23 22:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

实验具体是这样的

1.封闭采用的脱脂奶粉，封闭时用含5%脱脂奶粉的PBST

2.抗体是我新订购的，abcam公司的单抗，货号为ab47455,1:500、1:1000都做过没处

3.我把蛋白最多一次上了36微升，内参已经足有三毫米宽了，目的蛋白还是什么也没有

4.蛋白抽提采用的是普利来公司的总蛋白抽提试剂盒，在提取过程中添加了PMSF

5.转膜时采用的是预染maker，且做了丽春红染色，能看到膜上有蛋白

abcam的抗体三千多，如果换抗体又得两千多，但我觉得这么大的公司，不应该在抗体上出现问题啊，自己推断可能是蛋白抽提的问题，可是内参出

啊，抽提应该没问题啊，晕了，也要死了，今天一下午丝毫力气都没有了…………大家帮忙了！！！
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发表于 2013-11-23 22:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 flower@@ 于 2013-11-23 22:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

实验具体是这样的

1.封闭采用的脱脂奶粉，封闭时用含5%脱脂奶粉的PBST

2.抗体是我新订购的，abcam公司的单抗，货号为ab47455,1:500、1:1000都做过没处

3.我把蛋白最多一次上了36微升，内参已经足有三毫米宽了，目的蛋白还 ...

我建议你做个阳性对照看看是抗体的问题还是样本的问题。该抗体的阳性对照是Hela lysate
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flower@@[使用道具]
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发表于 2013-11-23 22:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2013-11-23 22:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


我建议你做个阳性对照看看是抗体的问题还是样本的问题。该抗体的阳性对照是Hela lysate

这种阳性对照如何能够获得呢？
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发表于 2013-11-23 22:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 flower@@ 于 2013-11-23 22:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


这种阳性对照如何能够获得呢？

就是Hela细胞裂解物啊，Hela细胞大量表达这个HSP70蛋白
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-11-23 23:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
使用大量细胞，IP后WB？也许含量真的少。——先RT-PCR或者real time PCR看看嘛。

Abcam，Santa抗体不是最好的。

改用其他公司的一二抗。

最好是根据著名文献。

选择序列表位抗体，也就是抗体公司推荐于WB的。

用进口的细胞裂解液。

加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，进口的。

用TBST?
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