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标题:【求助】包涵体用8M尿素也不溶怎么办?

douding66[使用道具]
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发表于 2013-11-24 00:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】包涵体用8M尿素也不溶怎么办?


各位老师和战友:
我的包涵体用8M尿素溶解之后还是很浑浊,我感觉还有一半多的包涵体没有溶解,你们有没有好的方法推荐给我,让包涵体更好的溶解呢?我被这个包涵体整得都快郁闷死了,请帮帮我哈!
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2013-11-24 00:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有两个原因可以影响尿素溶解包含体。
第一是温度：buffer得温度越高越容易溶解，而温度太低不利于溶解，建议升高温度。
第二是PH，PH越高越容易溶解，低于7，效果会差很多，建议ph升到8或者以上。
如果这样都做了仍然不行，

另外你可以试试我的一个小窍门吧。
就是将你的包涵体先用8M尿素通过玻璃棒的搅拌悬浮起来，然后呢，去超声。
可以超声5s，间隔3s，超声50次左右。应该会溶了。
第一，超声比搅拌的效果要好。
第二，超声时，温度会升高，利于变性溶解。
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发表于 2013-11-24 00:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以试试加大尿素的量，延长溶解时间，我们一般过夜的效果还不错。
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ffaa[使用道具]
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发表于 2013-11-24 00:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 douding66 于 2013-11-24 00:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位老师和战友:
我的包涵体用8M尿素溶解之后还是很浑浊,我感觉还有一半多的包涵体没有溶解,你们有没有好的方法推荐给我,让包涵体更好的溶解呢?我被这个包涵体整得都快郁闷死了,请帮帮我哈! ...

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阿k[使用道具]
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发表于 2013-11-24 00:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我怀疑你的包涵体是不是不纯，没有破碎好，含有较多的菌体细胞，可以用显微镜看一下
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douding66[使用道具]
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发表于 2013-11-24 00:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以告诉我你们粗提纯包涵体的方法吗?
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douding66[使用道具]
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发表于 2013-11-24 00:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有两个原因可以影响尿素溶解包含体。
第一是温度：buffer得温度越高越容易溶解，而温度太低不利于溶解，建议升高温度。
第二是PH，PH越高越容易溶解，低于7，效果会差很多，建议ph升到8或者以上。
如果这样都做了仍然不行，

另外你可以试试我的一个小窍门吧。
就是将你的包涵体先用8M尿素通过玻璃棒的搅拌悬浮起来，然后呢，去超声。
可以超声5s，间隔3s，超声50次左右。应该会溶了。
第一，超声比搅拌的效果要好。
第二，超声时，温度会升高，利于变性溶解。

请问您用多大功率超声???
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发表于 2013-11-24 00:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我这里超声一般是冰浴，250w，超声10s，间隔10s，直到液体清亮，离心后洗涤包涵体二次，加8M尿素溶解，PH值调高，建议到8以上，也可以加入DDT或者巯基乙醇试试，我通常放在4度大约在16小时以上，你可以试试
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脱水萝卜[使用道具]
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发表于 2013-11-24 00:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能你的包涵体比较紧密难以裂解，你可以使用盐酸胍，盐酸胍溶解包涵体蛋白质能力比尿素强，而且尿素中的异氰酸酯可以使自由氨基氨甲酰化（这种作用在碱性条件下表现的更强），所以常常首选盐酸胍作为解离剂。对含有分子间二硫键或非天然二硫键的包涵体蛋白质，在溶解过程中需要加入还原剂，如二硫苏糖醇，β-巯基乙醇，还原型谷胱甘肽，加入螯和剂，如EDTA，可以防止金属催化的半胱氨酸氧化。除此之外，改变pH和使用表面活性剂也被用于溶解包涵体蛋白质，相对而言，这两种方法的应用较少，而且只有具有正确二硫键的包涵体蛋白质才可以用表面活性剂进行溶解
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sr9971[使用道具]
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发表于 2013-11-24 00:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一楼的战友我跟你一样的情况，你现在溶解的情况有没改善？我的包涵体沉淀洗涤后是发黑发灰的，是不是破碎的时候已经出问题了使蛋白变性无法溶解了？请高手指点
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