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标题:【求助】求教胞核蛋白质提取

bs4665[使用道具]
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发表于 2013-11-24 11:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】求教胞核蛋白质提取

各位老师，我想提取细胞核蛋白质，所查资料中有EGTA和EDTA，都是金属螯合剂，如果不加EGTA，对结果影响大么？盼指教，多谢！
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-11-24 11:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用EGTA和EDTA可以去掉些微量的金属离子，而这些微量的金属离子正是各种酶的活性所需要的，因此不加会影响你提取甚至分离纯化的，这两种物质应该好去的，加有什么关系呢，不加估计不太好，当然你运气好的话也许没有关系，但是建议还是加吧。
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bs4665[使用道具]
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发表于 2013-11-24 11:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 vvmmoy 的帖子

谢谢您的指教，没有想到这么快就会的到答复，多谢！！！只是EGTA比较少用，所以一直没有搞到。
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-11-24 11:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这两种试剂作用是一样的，所以可以互相代替应该没有问题的，所以只加EDTA就可以了。
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bs4665[使用道具]
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发表于 2013-11-24 11:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我按照您说的方法提取蛋白质，结果前两个浓度还可以，在8微克/5个微升以上，后面的浓度却越来越低，由3到1甚至以下，
1.不知道是不是与放置的时间有关系，
2.另外加样的量至少要加多少微克，我用的泳道最多加20微升，
3.还有电泳和转膜时需要的电流至少需要多少，7毫安够么。只调整电压可以么？
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2013-11-24 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主放了多长时间？核蛋白提出来后应在-80放置，分装避免反复冻融。你是用来核蛋白做什么呀？WB？
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bs4665[使用道具]
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发表于 2013-11-24 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的核蛋白提取出来是放在-20度，上午提的,下午测的浓度. 因为量很少，大约是40微升吧，没有分装。

是用来做WB的，因为要看这个蛋白在胞核的表达量，它在胞核中是激活状态.

如果显色用DAB显色,封闭液应该用什么好一些呢,我看的资料说SABC法不宜用脱脂奶粉封闭,吐温20或者5%的脱脂奶粉/吐温可以么?

电泳和转膜时的电压和电流需要达到多少呢,望指教,多谢!!!
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发表于 2013-11-24 11:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电泳稳压80V-120V
转移稳压40V
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-11-24 11:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般你的蛋白浓度在1mg左右/ml，这样你就不用浓缩了，电泳的量10-15ng就可以了，太浓太淡都不好，但是如果是糖蛋白也许加样就要多点。提取的浓度和裂解提取液的pH缓冲液盐浓度等都有很大的关系，当然也和本身这个蛋白的含量有关，得看你提取蛋白的性质了。
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发表于 2013-11-24 11:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现就我在这方面的一些经验拿出来和您一起探讨一下，但愿能对您有一些帮助。
我在提取核蛋白时参照的梁国栋主编的《最新分子生物学实验技术》中的细胞核提取物的快速制备法，大约在1小时即可获得与传统方法质量相似的核蛋白提取物。首先要配BUFFER A液和BUFFER B液，其中在B液中要加EDTA金属螯合剂，加DTT、PMSF等蛋白酶抑制剂，但就我的经验后二者不加也可以。
如果你提的蛋白只是做WESRERN BLOT的话，放在-20度就可以啦，如果您要做EMSA的话还是放在-70度好些。
核蛋白做WESRERN BLOT，我的上样量是20-30微克，做出的结果很漂亮的。
电泳为恒压，60V过积层胶，然后换为80V，大约3小时左右就差不多啦。
转移：若您用的是半干法，那么稳压15V，45分钟就够啦。
一般我提的核蛋白浓度在1-25之间，所以你的蛋白浓度只要大于1，其实不需要浓缩的，关于您说的你的泳道只能上20微升量的话，我想您可以换厚一些的或宽一些梳齿，上样量可以达到40微升的。
另外，我要指出一点，即使WESRERN BLOT做出了阳性结果也不能说明他就是激活状态的，只能说明他有可能已经发生了核转位而已。
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