小中大【求助】 Western可以做出 ERK，却做不出P-ERK
我购买的抗体（ERK1/2,P-ERK）是CST公司的
我的目的是裂解细胞，检测这两种蛋白的表达。我现在碰到的问题是：ERK1/2出结果了，而p-ERK1/2做了2次了，没有结果。我把我的步骤给您看一下，请您帮忙分析一下，谢谢。
1) 取老鼠大脑组织用细胞裂解液（买的，含PMSF，磷酸酶酶抑制剂），冰上研磨，研磨后，在15000*6min, 4℃，取上清，分装，放于-80°冰箱保存
2) 跑SDS－PAGE，之前用2倍的上样buffer煮5min，一部分胶用于考马斯亮蓝染色，一部分胶用于转印，染色后的胶，目的蛋白含量高（说明提纯蛋白这个步骤没有问题），转印也较完全(用的预染marker做对照)
3) 我用的是PVDF膜(millipore)，先用甲醇泡3min，，转完后，先放入TTBS（10mM Tris+0.9%Nacl, PH 7.5）洗一下，再用5%脱脂奶粉（1*TTBS配）室温1h,TTBS洗，再加一抗p-ERK（1：500，稀释液用5%的BSA），4度过夜，TTBS洗，再加二抗抗兔的（1：1000，稀释液用TTBS），TTBS洗，DAB显色(试剂盒)。一片空白！
4) 我做的ERK1/2，步骤完全同前，出来结果了！
上面就是我的步骤与碰到的问题，请各位师兄师姐帮忙分析一下，抗体估计没有问题，而且这个动物模型取的时间点是有PERK表达的，是不是因为我的操作哪个步骤有问题？
万分感激！
