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蛋白切胶纯化
一、实验耗材与试剂
50mL离心管（可以反复使用，用前洗净）、玻璃棒（用于捣碎SDS-PAGE胶条）、高速离心机。
蛋白切胶缓冲液：
20mmol/LTris-HCl（pH7.5），0.1mmol/LEDTA，1%SDS
3×SDS Loading Buffer：
3×SDS Sample Buffer：4度保存 可以用自己配置的尽量倍数高一些，溴酚蓝少一些
187.5mM Tris-HCl(pH6.8)
6%(w/v) SDS
30% glycerol(甘油)
0.03% bromphenol blue(溴酚兰，量越少越好)
15% b-巯基乙醇
蛋白电泳相关试剂
所用器材要洁净。
二、实验步骤
1、大量诱导表达目的融合蛋白
挑取单克隆鉴定的阳性重组表达菌，接种于5ml Ap/LB液体培养基中，37℃，200r/min摇菌培养过夜。(保存的菌，培养6---8hours,即可进行转接到300mL的LB中培养)
吸取菌液按1: 100的比例接种于5ml Ap/LB液体培养基中，37℃，200r/min摇菌培养至OD600=0.6~0.8（约2-3h）。
取1ml的菌作为对照，剩余300ml加入IPTG，使终浓度为0.5mmol/L，于16℃，200r/min振摇诱导培养16-20h。（一般20度诱导12h；25度诱导8h；30度诱导6h；37度诱导4h）
集菌：5000---8000rpm 4度离心10min，弃尽上清，菌体用PBS或生理盐水重悬洗涤离心一次，弃去上清。菌体沉淀保存于-20度。
首先看一下蛋白是否表达，在已知表达及表达形式（蛋白可溶性分析）的情况下，可以直接进行下面的超声。
2、超声：
300ml诱导表达的菌体用35—40ml的PBS重悬，进行超声细胞破碎。条件是：超声3s、停3s、25%、超声时间25min。（具体的条件可以按自己的进行，保证菌体细胞超声破碎彻底）。
超声后的溶液可以取1ml保留用于写文章时的蛋白可溶性分析图片用。超声后溶液8000rpm 4度离心10min，上清和沉淀分别保存。沉淀包涵体进行蛋白切胶纯化。
3、电泳：
配制相应浓度SDS_PAGE胶：
下面分离胶可以适当的少一些，上面5%的浓缩胶层窄一些，如果没有单孔梳子的话可以用水压平，直接把蛋白电泳样加在孔里。总的原则是：使上样的体积尽可能的多。
SDS-PAGE蛋白电泳样的制备：
包涵体沉淀用1.5—5ml的PBS重悬，加入3×SDS Sample Buffer，用移液枪或振荡器充分混匀。（不要沸水煮沸处理，上面处理的样品可以直接进行电泳，上样里面有少量颗粒物也没问题，不影响切胶）蛋白越浓越好，切胶纯化获得的蛋白浓度及上样蛋白量就越多。
SDS-PAGE电泳：
一次电泳用两块胶进行电泳，电压一般的就行，电泳缓冲液要用新配制的，上样的体积应该在1.2---2mL之间。
