小中大2.1 抗体的纯化
抗体在亲和层析试剂中所占地位日趋重要,所以纯化抗体的方法也倍受关注。抗体通常是从血清、杂交瘤上清或腹水中获得[9]。
2.2 抗原的纯化
在蛋白质纯化中用抗体亲和纯化抗原是非常有效的方法。一般纯化倍数可达到1000~10000倍。如果抗体与目的蛋白的结合的特异性得到证明,并且经过洗脱的目的蛋白没有受到可逆的损伤,那么抗体亲和纯化将是理想的蛋白质纯化方法[10]。
抗体亲和纯化的质量很大程度上取决于抗体溶液的纯度,制备亲和柱的抗体既要良好的特异性和活性,又要尽可能的纯。抗体亲和柱的制备是相当昂贵的,其结合容量却相对较低。因此为了节省和提高效率,经常制备的是小而粗的柱子,同时在亲和纯化步骤里要求样品溶液重复几次上样,以便纯化更多的抗原蛋白。此外,较小的柱子也可以减少和限制柱污染和抗体丢失。
2.3 应用举例
免疫亲和色谱在实验室被广泛用于蛋白质的分离纯化,目前IAC在治疗产品大规模生产上的应用受到价格、配体的渗漏和IAC吸附剂抗原结合容量低等问题的限制。单抗问世后、不少生物技术公司在研制适宜于培养杂交瘤细胞的生物反应器及其培养基,这些大规模生产单抗技术的建立和不断完善将降低IAC吸附剂的价格[10]。随着新的合成基质和偶联化合物的出现以及对IAC研究的深人,必将使免疫亲和色谱在工业性生产纯化蛋白质的应用逐渐得到发展。
赵益明、何杨[11]等用单克隆抗体亲和层析从人血小板破碎液中纯化血小板第4因子(PF4)。将单克隆抗体Sz—95—LgG与溴化氰活化的Spharose 4B凝胶连接成亲和层析柱Sz—95—LgG—Spharose 4B,人血小板破碎液经此亲和层析柱上样后,经洗脱获得PF4。结果表明,Sz—95—Sepharose 4B亲和层析柱的偶联率为72%,每1m1血小板破碎液中可以纯化到PF4 18ug,其相对分子量约为12kD,经点印迹显示与单抗Sz—95反应显带。该层析柱纯化败效果较好。
3 金属离子亲和层析
3.1 基本原理[12]
组氨酸的咪唑基团,半胱氨酸的巯基,色氨酸的吲哚基团可提供电子,与金属离子结合。当这些氨基酸残基与金属离子结合后,含这些残基的蛋白质在亲和层析柱中受到阻滞。用螯合剂将金属离子固定在固体表面会减少蛋白质—金属相互反应的自由度,蛋白质也因此不容易失活,在后继的分离纯化过程中仍然保持较高活性。
3.2 固定化金属离子亲和层析柱的制法[13,14]
将柱子浸没于某种金属离子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、CO2+)缓冲液中,直至螯合到固定相上的金属离子和溶液中的金属离子达到平衡。固相载体,通常是多聚物(如交联化的琼脂糖,葡聚糖),配位体(亚氨基二乙酸,IDA)共价连接.当在缓冲液中浸泡平衡后,经洗涤,可将含有生物活性物质的样品上柱,与固定化金属—配基有亲和力的分子都将被滞留,其余则流出柱外。
3.3 固定化金属离子亲和层析的优点
和传统的亲和层析相比,固定化金属离子亲和层析具有以下优点[12]:(1)配基稳定性高,不易脱落;(2)金属离子配基价格低廉,再生成本低;(3)可在高盐浓度下操作,从而省去了脱盐的预处理步骤,而且可以减少非特异性吸附;(4)蛋白质洗脱比较容易,采用较低pH或采用竞争性物质如咪唑,EDTA,便可将吸附蛋白解吸下来。
金属离子亲和层析是利用金属离子的络合或形成螯合物的能力来吸附蛋白质的分离系统。目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基,如组氨酸的基、色氨酸的吲哚基,十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合。锌和铜己发现能很好的与组氨酸的咪唑基巯基结合[10]。常用的金属离子有Cu、Ni、Zn、Co等。金属盐的种类和结构,流动相的组成、PH值、离子强度等会影响亲和层析的效果。
金属离子亲和层析具有以下优点[14]:(1)蛋白质吸附容量大,是天然配基结合量的1O—100倍:(2)价格便宜,投资低:(3)具有普遍适用性.金属离子配基具有很好的稳定性,吸附容量大,成本很低,且层析柱可长期连续使用,易于再生。